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慢性HBV感染者肝组织中HBV cccDNA定量检测方法的建立

作　者: 宋培新
导　师: 李军
学　校: 南京医科大学
专　业: 内科学
关键词: 慢性HBV感染者 HBV ccc DNA 跨缺口引物核酸酶消化荧光定量PCR SYBR Green I Taqman探针
分类号: R450
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

慢性乙型肝炎病毒感染是世界范围内的主要公共卫生问题之一，约有四亿人受其影响。乙肝病毒基因组DNA为松弛环状DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)，进入肝细胞核后转换为共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)，并在整个自然病程中持续存在。目前应用的抗病毒药物，如核苷类似物、α-干扰素等，能够有效清除外周血中的HBV DNA，但对细胞核内cccDNA的影响甚微，从而成为感染持续且难以根治的关键因素之一。由于在乙型肝炎发病机制和抗病毒治疗中的重要地位，cccDNA检测方法的建立及其监测一直受到广泛重视，目前已经发展至将实时荧光定量PCR应用于定量检测，但是方法学上仍然存在诸多问题，细胞内其他病毒复制中间体如rcDNA的非特异性扩增是主要问题之一，此外在灵敏度、精确度、可操作性等方面仍有待提高，因此目前尚没有国家批准的试剂盒上市。本研究旨在建立一种具有较高特异性、精确度、灵敏度和可操作性的HBV cccDNA定量检测方法，以便于基础和临床研究中广泛应用。该方法的主要内容为：取约10mg肝组织，用细胞裂解缓冲液和蛋白酶K充分消化，用液相抽提法提取核酸并用乙醇沉淀，将提取的核酸溶液分为两等份：一份用特异性降解单链DNA的核酸酶加以消化，经DNA纯化后，使用跨缺口引物进行实时荧光定量PCR分析；另一等份则用以定量检测肝细胞看家基因(β-Globin)作为内部参照，最后得出每个肝细胞中所含有的HBV

全文目录

中文摘要(关键词)  3-6
英文摘要(关键词)  6-9
第一部分慢性HBV感染者肝组织中HBV cccDNA定性PCR检测及其特异性分析  9-25
  引言  9-10
  材料与方法  10-14
  结果  14-18
  讨论  18-21
  参考文献  21-25
第二部分慢性HBV感染者肝组织中HBV cccDNA定量检测方法的建立  25-41
  引言  25
  材料与方法  25-30
  结果  30-36
  讨论  36-38
  参考文献  38-41
小结  41-43
致谢  43-44
发表的相关论文  44-54
综述及参考文献  54-64
其他论文  64-71
论文独创性声明  71
论文使用授权声明  71

慢性HBV感染者肝组织中HBV cccDNA定量检测方法的建立

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