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重组人巨细胞病毒（HCMV）嵌合肽的构建及其在毕赤酵母中的表达

作　者: 郑育声
导　师: 谢琪璇
学　校: 暨南大学
专　业: 发育生物学
关键词: 人巨细胞病毒重组嵌合肽 pPIC9K 巴斯德毕赤酵母重组PCR 表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
下　载: 102次
引　用: 2次
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内容摘要

为了表达人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）中抗原性较强的两段蛋白片段—gp52C末端和pp150C末端的嵌合肽，用基因工程技术构建适于酵母表达系统的重组表达质粒。将重组质粒转化巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）以此表达目的蛋白，并对表达蛋白进行鉴定。根据人巨细胞病毒糖蛋白gp52和磷酸蛋白pp150C末端的cDNA序列，设计出2对引物。利用重组PCR的方法，以病毒培养液上清为模板，把二个目的基因串联在一起。所得的DNA片段经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后用T₄DNA连接酶与pPIC9K载体进行连接，然后导入大肠杆菌DH5α，用PCR法筛选阳性转化子，并用双酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。重组质粒线性化后，用电击法将重组质粒转化入巴氏毕赤酵母，在缺组氨酸的MD板上筛选阳性菌落，然后用不同浓度的G418—YPD板筛选多拷贝插入单菌落。培养多拷贝插入的酵母细胞，用甲醇诱导目的蛋白的分泌，SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达蛋白。重组PCR扩增出两端带有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的目的基因片段。目的基因经双酶切后连接载体pPIC9K，然后导入大肠杆菌DH5α中，在含氨卞青霉素（AMP）的LB板上用PCR反应筛选出阳性菌落，双酶切结果表明目的基因已插入载体中，且方向正确，测序结果进一步证明人巨细胞病毒重组基因表达质粒成功地克隆了目的基因片段。重组质粒转化巴氏毕赤酵母，G418筛选出多拷贝插入的单克隆，甲醇诱导多拷贝插入的单克隆酵母细胞分泌目的蛋白，培养液上清经SDS-PAGE电泳分析，在蛋白质印迹中检测到培养液上清有一表观分子量为36KD，能与羊抗HCMV多克隆抗体发生发应的条带。实验结果表明重组人巨细胞病毒嵌合肽成功地在巴斯德毕赤酵母中获得表达。

全文目录

1 前言  8-18
  1．1 人巨细胞病毒的一般特征  8-9
  1．2 HCMV感染的危害性  9
  1．3 目前HCMV的诊断技术  9-10
  1．4 目前HCMV诊断技术存在的问题  10-11
  1．5 本研究课题的立论依据  11-16
  1．6 本研究的目的和意义  16-17
  1．7 本研究的技术路线  17-18
2 实验仪器、材料和试剂  18-22
  2．1 主要仪器  18-19
  2．2 材料  19-20
  2．3 试剂  20-22
3 实验方法  22-34
  3．1 重组基因表达质粒的构建  22-30
  3．2 重组质粒在酵母（Pichia pastoris）中的表达  30-34
4 实验结果  34-41
  4．1 目的基因的PCR扩增结果  34-35
  4．2 双酶切后的目的DNA与载体  35-36
  4．3 重组质粒的鉴定结果  36-37
  4．4 重组质粒的序列测定结果  37
  4．5 嗜甲醇酵母的转化  37-38
  4．6 多拷贝插入转化子的筛选  38
  4．7 目的蛋白的鉴定结果  38-41
5 讨论和小结  41-48
  5．1 酵母表达系统表达HCMV抗原的优越性  41-44
  5．2 目的肽段的串联  44
  5．3 重组质粒的构建结果分析  44-45
  5．4 重组质粒在酵母细胞中的转化  45-46
  5．5 重组质粒在酵母细胞中的表达  46-48
6 参考文献  48-53
论文发表情况  53-54
致谢  54-55
附录一各种试剂的配制方法  55-61
附录二重组质粒的测序结果  61-64

重组人巨细胞病毒（HCMV）嵌合肽的构建及其在毕赤酵母中的表达

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