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嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药性的分子机制

作　者: 郑伟
导　师: 韩文瑜
学　校: 中国人民解放军军需大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 嗜水气单胞菌 氟喹诺酮类药物 耐药机制
分类号: S852.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要


嗜水气单胞菌能引起鱼类、两栖类、爬行类、鸟类、哺乳类动物的多种疾病。氟喹诺酮类药物是治疗由该菌引起疾病的有效药物，因其价格低、副作用小，广谱高效而被广泛使用。但是细菌对氟喹诺酮类药物容易产生耐药性，目前常见的一些致病性细菌，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等都出现了对氟喹诺酮类药物具有很高耐药水平的菌株被报道，对其耐药机制也有详细研究，此类研究对指导正确用药、发展新药具有重要意义。有关嗜水气单胞菌对氟喹诺酮类药物耐药的状况及耐药性分子机制的研究尚未见报道。本研究旨在调查吉林省内嗜水气单胞菌的耐药情况，研究其对氟喹诺酮类药物耐药的分子机制。 首先从吉林省内12个水域送检和出诊检查的66尾病鱼体内分离出46株疑似株，再用生化鉴定法和PCR检测aer基因方法鉴定出嗜水气单胞菌22株，进一步用药敏纸片法和双倍稀释法筛选耐氟喹诺酮类药物如氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星的菌株，按耐药菌的判定标准共检测出4株耐药菌，耐药菌的检出率分别为9.1％、18.2％、13.6％。将6株敏感菌和2株耐药菌同时培养、0.9％生理盐水洗涤、离心后，经磷钨酸负染，电镜观察，比较细菌表面差异。电镜下观察发现，2株耐药菌表面有均匀分布的球形结构，而6株敏感菌表面未见此结构。 根据杀鲑气单胞菌gyrA全序列设计A1：AGAGTTCCTATCTTGATTACG A2：CTGTGATGTAGGTCATCAACT B1：GGACGAGCTCTGCCGGATGTG B2：GATGCCATACCTACCGCGATA两对引物，将筛选出的耐药菌4株、敏感菌2株煮沸变性处理后作为DNA模板，扩增gyrA喹诺酮抗性决定区588 bp片段。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分离，回收后与pMD18-T载体连接转入大肠杆菌DH5α中，涂布于Amp抗性X-Gal平板，培养后挑取白斑阳性克隆，鉴定后测序。将其中一株的碱基序列结果与网上NCBI GenBank中嗜水气单胞菌（敏感菌）对应的441 bp序列比较，相同碱基占98％。用DNA star分析比较核苷酸序列存在31个突变位点，蛋白序列找出4个氨基酸残基突变位点，分别是83位点的Ser→Ile（4株耐药菌），92位点的Leu→Met（4株耐药菌），174位点的Ile→Phe（3株耐药菌），202、203位点的Asn、Leu→Asp、Arg（3株耐药菌，另一株Leu未突变），经查还发现耐药菌突变后的氨基酸残基均比敏感菌正常的相对应氨基酸残基分子量增大。上述突变位点与大肠杆菌、杀鲑气单胞菌、伤寒沙门杆菌、淋病奈瑟菌等比较共同点为83位点的Ser—！ie，而绿脓假单胞菌83位点Thr—lie，其余位点则各不相同，许多报道认为GyTA亚单位氟隆诺酮抗性突变多集中在 67～106氨基酸位点，本实验结果表明除该区的 83、92位点突变以外，174、202和 203也发生突变。另外，大肠杆菌、杀鲑气单胞菌、伤寒沙门杆菌、淋病奈瑟菌等所具有的保守位点 122位 Tyr，本实验结果与其完全相同。其中两株耐药菌 A．h of、A．h 02 d p诺酮抗性决定区序列己登录在GenBank数据库，注册号为AY039655，AY039656。 将嗜水气单胞菌标准株在LB培养基中增菌后，用苯酚氯仿混合提取法提取染色体 DNA，以平皿法测定其浓度为 lpg／…，DNA总量约 3mg。用 BamH酶切上述染色体DNA，0．8％低溶点琼脂糖电泳，结果形成条带不清晰的涂抹带 厂收其中大约为 2～4 kb片段。同时采用碱裂解法大量提取 pUC质粒并纯化，BamH酶切，CIAP去磷后，回收线性质粒，以 T。连接酶与染色体二～4 kb片段连接，同时做连接预实验作对照，连接产物转化入大肠菌DHS。作为基因组选择性文库。于 LB培养基中增菌后，涂 X－Ga平板，培养 16 h后取出，对菌落记数，制膜后，封口，4oC保存。库容量为2．7 X 10’，载体转化效率为 4二X 10、fll／p。将所制硝酸纤维素膜依次变性、中和、洗涤、交联、冻干、预杂交，用PCR扩增的嗜水气单胞菌见M睦诺酮抗性决定区588 hp片段作为探针，以碱性磷酸酶标记，进行杂交。经洗膜，滴加含有化学发光剂的检测液，进行发光检测，选择出膜上阳性信号强的斑点对应的两株菌落，将进一步对相应克隆进行鉴定和亚克隆。

全文目录


中文缩略语  5-9
前言  9-11
文献综述  11-18
实验一 耐喹诺酮类药物嗜水气单胞菌的分离鉴定及电镜观察  18-25
  1 材料  18-19
  2 方法  19-20
  3 结果  20-23
  4 讨论  23-25
实验二 耐药性嗜水气单胞菌gyrA喹诺酮抗性决定区扩增与分析  25-39
  1 材料  26-28
  2 方法  28-30
  3 结果  30-36
  4 讨论  36-39
实验三： 嗜水气单胞菌基因组选择性文库的建立及gyrA全序列克隆的初步筛选  39-47
  1 材料  40-41
  2 方法  41-44
  3 结果  44-45
  4 讨论  45-47
结论  47-48
参考文献  48-55
英文摘要  55-57
致谢  57-58
英文个人简历  58-67

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学）
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