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牛、鸡和猪γ-干扰素的克隆表达与单克隆抗体的研制

作　者: 秦立廷
导　师: 刘思当；步志高
学　校: 山东农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 干扰素表达抗病毒活性单克隆抗体
分类号: S852.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

干扰素(interferon,IFN)是在特定的诱生剂作用下,由细胞产生的一种具有高度生物活性的糖蛋白,在同种动物细胞上具有广谱抗病毒活性。根据IFN蛋白的氨基酸序列、细胞来源以及它们所结合受体的不同,将其分为Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN,Ⅱ型IFN主要是γ-干扰素(interferon-gamma, IFN-γ),除具有Ⅰ型IFN抗病毒活性外,还具有独特的免疫调节功能和抗肿瘤作用。由于IFN-γ对机体免疫系统具有极大的调节作用,是机体发挥免疫功能,清除体内病原体不可缺少的成分,因此,IFN-γ在疾病的诊断、治疗和疫苗免疫效果检测等方面起着重大作用,是现代分子生物学,免疫学和临床医学研究的热点之一。本研究通过PCR扩增出不包含信号肽的牛、鸡和猪IFN-γ的基因,分别构建了原核表达质粒pET-BoIFN-γ、pET-ChIFN-γ和pET-PoIFN-γ,转化BL21宿主菌,经IPTG诱导,表达牛、鸡和猪IFN-γ的重组蛋白。乳化后免疫兔子获得抗IFN-γ特异性免疫血清,抗牛、鸡和猪IFN-γ血清抗体效价分别为:1:1×10~4、1:1×10~6和1:1×10~5。为了探讨牛、鸡和猪IFN-γ在真核细胞中的表达,从而获得具有高效抗病毒活性的重组IFN-γ,本研究构建了包含完整ORF的重组真核表达质粒pCAGG-BoIFN-γ、pCAGG-ChIFN-γ和pCAGG-PoIFN-γ,转染293T细胞,瞬时表达牛、鸡和猪IFN-γ重组蛋白,从而证实IFN-γ基因可以在哺乳动物细胞中表达,并能借助于自身的信号肽分泌到细胞外,通过VSV*GFP-MDBK(CEF、PK-15)系统细胞病变抑制法,测定重组IFN-γ具有高效抗病毒活性,牛、鸡和猪γ-干扰素抗病毒活性均为:2×10~5IU/ml。为了大量获得在结构和功能等方面更接近天然,并且具有一定临床应用价值的重组IFN-γ,本研究构建了包含完整ORF的重组杆状病毒rBac-BoIFN-γ、rBac-ChIFN-γ和rBac-PoIFN-γ。间接IFA和间接

全文目录

英文缩略表  8-10
中文摘要  10-12
英文摘要  12-15
引言  15-33
  1 IFN-γ理化特性及分子结构  16-17
  2 IFN-γ信号传导的分子机制  17-20
  3 IFN-γ产生及诱导剂  20-21
  4 IFN-γ生物学活性及其作用机制  21-25
    4.1 抗病毒活性  21-23
    4.2 免疫调节活性  23-24
    4.3 抗肿瘤活性  24-25
  5 IFN-γ的应用及发展前景  25-31
    5.1 在疾病诊断和免疫学检测方面的应用  26-29
    5.2 作为疫苗免疫佐剂的应用  29-30
    5.3 在临床治疗方面的应用  30
    5.4 提纯基因工程重组干扰素  30-31
  6 研究目的和意义  31-32
  7 研究内容和方法  32-33
试验部分  33-80
  试验一牛、猪和鸡 IFN-γ的原核表达及特异性免疫血清的制备  33-44
    1 材料和方法  33-38
      1.1 质粒与菌种  33-34
      1.2 扩增引物  34
      1.3 主要试剂  34
      1.4 含有牛、猪和鸡 IFN-γ基因原核表达质粒的构建与鉴定  34-36
      1.5 大肠杆菌表达重组 IFN-γ蛋白及SDS-PAGE  36
      1.6 重组IFN-γ蛋白的纯化  36-38
      1.7 抗IFN-γ特异性高免血清的制备  38
    2 结果  38-42
      2.1 PCR 扩增 IFN-γ目的基因  38-39
      2.2 pET-IFN-γ的酶切鉴定结果  39-40
      2.3 原核表达重组 IFN-γ蛋白的鉴定  40-41
      2.4 间接 ELISA 测定兔抗 IFN-γ特异性多克隆抗体效价  41-42
    3 讨论  42-44
  试验二牛、鸡和猪γ-干扰素在哺乳动物细胞中的瞬时表达及抗病毒活性的测定  44-53
    1 材料和方法  44-48
      1.1 质粒、细胞系与菌种  44-45
      1.2 主要试剂  45
      1.3 重组真核表达质粒pCAGG-IFN-γ的构建与鉴定  45-46
      1.4 转染  46-47
      1.5 间接IFA 检测IFN-γ表达  47
      1.6 间接ELISA 检测IFN-γ表达  47
      1.7 重组IFN-γ抗病毒活性测定  47-48
    2 结果  48-52
      2.1 pCAGG-IFN-γ质粒的构建及鉴定  48
      2.2 间接 IFA 结果  48-49
      2.3 间接 ELISA 结果  49-50
      2.4 重组IFN-γ抗病毒活性测定  50-52
    3 讨论  52-53
  试验三牛、鸡和猪γ-干扰素在杆状病毒中表达及其抗病毒活性的测定  53-70
    1 材料与方法  54-60
      1.1 质粒、受体菌、细胞系及其培养基  54
      1.2 主要试剂  54
      1.3 细菌培养基  54
      1.4 引物  54-55
      1.5 表达牛、鸡和猪γ-干扰素的重组杆状病毒的构建  55-59
      1.6 间接IFA 检测rBac-IFN-γ在昆虫细胞中的表达  59
      1.7 间接 ELISA 检测rBac-IFN-γ在昆虫细胞中的表达  59-60
      1.8 重组 IFN-γ抗病毒活性测定  60
      1.9 重组 IFN-γ抗病毒活性阻断试验  60
    2 结果  60-68
      2.1 重组供体质粒pFBac-IFN-γ的构建及鉴定  60-61
      2.2 重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-IFN-γ的提取和鉴定  61-62
      2.3 重组杆状病毒rBac-IFN-γ的 PCR 鉴定  62-63
      2.4 间接 IFA 检测 IFN-γ表达  63-64
      2.5 间接 ELISA 检测 IFN-γ表达  64-65
      2.6 重组 IFN-γ抗病毒活性测定  65-67
      2.7 重组 IFN-γ抗病毒活性阻断试验  67-68
    3 讨论  68-70
  试验四抗牛和猪γ-干扰素单克隆抗体的研制及鉴定  70-80
    1 材料和方法  70-75
      1.1 免疫抗原、细胞系及其培养基  70
      1.2 实验动物  70
      1.3 主要试剂及耗材  70-71
      1.4 动物免疫  71
      1.5 细胞融合  71-72
      1.6 阳性杂交瘤细胞的筛选  72-73
      1.7 阳性杂交瘤细胞的克隆化、冻存和复苏  73-74
      1.8 单克隆抗体腹水的制备  74
      1.9 杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定  74-75
    2 结果  75-77
      2.1 单克隆抗体的筛选与单克隆杂交瘤细胞株的建立  75-76
      2.2 单抗腹水效价的测定和亚型鉴定  76
      2.3 Western Blot 检测单克隆抗体特异性  76-77
    3 讨论  77-80
结论  80-81
参考文献  81-93
附录  93-100
致谢  100-101
作者简介  101

牛、鸡和猪γ-干扰素的克隆表达与单克隆抗体的研制

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