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基于GFP的FRET监测树突棘钙动力学

作　者: 刘秀丽
导　师: 龚辉
学　校: 华中科技大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 海马神经元树突棘钙离子浓度 Cameleon FRET
分类号: Q421
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

细胞内钙离子作为传递信息的第二信使,对细胞生长分化起着重要作用。神经系统中神经递质的合成与释放、细胞间信息传递、树突的生长、树突棘的形成及突触可塑性等都与细胞内钙离子有着密不可分的关系。研究表明,树突棘内的钙离子参与调控多种信号途径,并且对长时程增强(LTP)和长时程抑制(LTD)有着重要贡献,而LTP 和LTD 目前被认为是学习和记忆的神经基础。因此监测海马神经元单个树突棘的钙浓度变化是研究突触可塑性分子和细胞机制的关键。激光共聚焦显微镜和钙离子荧光探针的发展实现了生理状态下树突棘内钙信号的检测。激光扫描共聚焦显微镜具有散射背景小、色差小、分辨率高等优势。基因探针是内源性大分子对细胞钙动力学影响小,同时,采用Ratio 成像可以定量探测钙离子浓度。本实验使用基于GFP 的钙离子基因探针——Cameleon 来研究了树突棘的钙动力学。首先,优化了细胞培养、磷酸钙转染方法,使用458 nm 激光代替430 nm 激光来进行荧光共振能量转移(FRET)探测。然后,比较了不同Cameleon 的动态范围,458 nm 激发时YC2.1、YC6.1 和YC3.60FRET 比值的变化范围分别为:33%,70%,220%。最后,初步完善了FRET 定量钙浓度的方法,应用于:(1)静息状态下的钙分布。在静息状态下,海马神经元的胞体、一级树突、二级树突、三级树突和树突棘内钙离子浓度分别为:104±22 nM,71±10 nM,55±6 nM,40±7 nM,56±14 nM,树突棘的钙离子浓度高于对应的树突证实了树突颈扩散屏障的功能; 同时发现,静息状态下树突棘内钙离子浓度分布范围13~80 nM,这种钙离子浓度的差异可能与树突棘的成熟度、功能以及钙运作方式等有关。(2)生理刺激对胞体和树突棘内钙离子浓度的影响。吹加谷氨酸来研究了神经元的胞体和树突棘的钙动力学,在100 μM 的谷氨酸的刺激下胞体内钙离子浓度从100 nM 上升到1 μM 左右,而树突棘内钙离子浓度从50 nM 上升达到500 nM。结果表明,利用Cameleon 的FRET 比值变化来定量监测树突棘钙动力学的方法是切实可行的,并可以进行实时、无损、长时间的监测,为研究神经递质、动作电位等刺激对树突棘内钙信号影响提供一种重要研究手段。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
1 绪论  8-18
  1.1 树突棘的钙离子  9-11
  1.2 钙离子检测  11-14
  1.3 激光扫描共聚焦显微镜的发展及应用  14-16
  1.4 本文研究的主要内容  16-18
2 大鼠海马神经元的培养  18-30
  2.1 实验器材  19-22
  2.2 培养用品的洗涤和消毒灭菌  22-23
  2.3 海马神经元的培养  23-26
  2.4 海马神经元培养过程中常见的问题和解决方案  26-29
  2.5 本章小结  29-30
3 质粒提取与磷酸钙转染  30-42
  3.1 质粒DNA 的提取  30-35
  3.2 原代海马神经元的转染技术  35-41
  3.3 本章小结  41-42
4 胞体内钙离子浓度的检测  42-56
  4.1 实验系统  42-43
  4.2 实验指示剂和探针  43-48
  4.3 胞体内钙离子浓度的检测  48-55
  4.4 本章小结  55-56
5 树突棘内钙离子浓度的检测  56-67
  5.1 溶液配制  56-57
  5.2 静态的钙离子浓度的分布  57-59
  5.3 刺激下树突棘内动态钙离子浓度的变化  59-62
  5.4 讨论  62-66
  5.5 本章小结  66-67
6 总结  67-68
致谢  68-69
参考文献  69-73
附录1 攻读学位期间发表的论文目录  73

基于GFP的FRET监测树突棘钙动力学

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