学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

贡嘎蝠蛾幼虫肠道细菌多样性分析

作　者: 卓凤萍
导　师: 殷幼平
学　校: 重庆大学
专　业: 药物化学
关键词: 贡嘎蝠蛾肠道菌群葡萄球菌 16SrRNA DGGE
分类号: S567.35
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 296次
引　用: 17次
阅　读: 论文下载

内容摘要

贡嘎蝠蛾(Hepialus gonggaensis)幼虫是名贵中药材冬虫夏草(Cordyceps sinensis)的优势寄主之一。人工培植中幼虫抗逆力弱,易受微生物感染,是影响冬虫夏草资源保护和开发的重要制约因子。研究贡嘎蝠蛾幼虫肠道菌群多样性,对于研究其营养生理,进而改善和研制人工饲料,提高幼虫抗逆力和成活率有重要意义。本研究以四川康定雅家埂山上采集的贡嘎蝠蛾为实验材料,按传统的培养分离方法对贡嘎蝠蛾幼虫的肠道细菌进行分离和鉴定。实验结果表明,贡嘎蝠蛾肠道细菌都属低温菌,最适生长温度15℃,在15℃培养2d 后才长出典型菌落。从肠道中分离纯化出12 个不同菌群,其中优势菌群为葡萄球菌(Staphylococcus ),菌群数量为2.05×109mL-1,检出率100%,应为幼虫肠道中的常住菌群,其它菌群检出率均低于50%,可能为肠道中的过路菌群。生化鉴定大多数菌群的符合值都较低,这与蝠蛾生活于高海拔高寒地区,其肠道微生物与常见微生物菌群有较大差异一致。利用分子生物学方法研究了贡嘎蝠蛾幼虫肠道细菌多样性。研究用根据大肠杆菌16SrRNA 基因保守序列设计的引物对贡嘎蝠蛾幼虫肠道基因组DNA 进行PCR 扩增,再利用变性梯度凝胶电泳对扩增得到的16SrDNA 序列进行直观分离。采用变性剂浓度范围为10%-60%时,分离得到12 条带,进一步缩小变性剂范围为25%-48%,最终分离得到76 条带。因为每个条带很可能就代表一个不同的微生物物种,所以DGGE 带谱中条带的数量和亮度,即可相应反映出该环境中微生物种类的数量及群落中的优势菌群。从实验结果可以看出,贡嘎蝠蛾幼虫肠道中存在着大量细菌,它们的种类和数量各不相同,即贡嘎蝠蛾幼虫肠道中具有丰富的细菌多样性。多次重复地从健康贡嘎蝠蛾幼虫体内取得肠道富集后,应用DGGE 技术进行研究,都可以得出比较一致的结果。由此可见,以DGGE 技术分离16SrDNA条带研究昆虫肠道细菌多样性是可行的。把DGGE 分离得到的最亮的8 条带进行纯化,克隆和测序,并对所得序列以分子信息技术进行BLAST 比对,结果表明:除3 条带外,其他条带的顺序与已知菌株的顺序都有较大的差异,暗示这些条带所代表的菌株可能尚未被人们获得并研究过,因此采用此方法对贡嘎蝠蛾幼虫肠道微生物进行研究将是可行的。在DGGE 与纯培养的比较研究中,两种方法检测到的细菌多样性结果不完全一致,说明每种方法都有一定的选择性和局限性,得到纯培养的物种并不一定是肠道环境中的真正的优势类群,它们或许只占环境中细菌总数的一小部分。

全文目录

中文摘要  4-5
英文摘要  5-10
1 绪论  10-13
  1.1 研究背景  10-11
  1.2 立论依据  11
  1.3 研究内容与目的  11
  1.4 技术路线  11-13
    1.4.1 贡嘎蝠蛾幼虫肠道可培养细菌的研究  11
    1.4.2 贡嘎蝠蛾肠道微生物的分子生物学研究(16SrRNA PCR-DGGE 法)  11-13
2 文献综述  13-25
  2.1 贡嘎蝠蛾研究进展  13
  2.2 肠道微生物对宿主生理功能的影响  13
  2.3 肠道微生物研究方法介绍  13-18
    2.3.1 传统的细菌系统分类鉴定方法  14-15
    2.3.2 肠道微生物的分子生物学研究方法  15-18
  2.4 16SrDNA 分析的PCR-DGGE 介绍  18-23
    2.4.1 变性梯度凝胶电泳原理简介  18
    2.4.2 变性梯度凝胶电泳的应用  18-20
    2.4.3 PCR-DGGE 应用实例  20-22
    2.4.4 PCR-DGGE 方法的优缺点  22-23
  2.5 昆虫肠道微生物研究进展  23-25
3 贡嘎蝠蛾幼虫肠道可培养微生物与优势菌群分析  25-31
  3.1 材料与方法  25-27
    3.1.1 研究材料  25
    3.1.2 培养基  25
    3.1.3 幼虫的解剖与肠道微生物的获取  25
    3.1.4 接种和培养  25
    3.1.5 菌落的计数、分离与鉴定  25-26
    3.1.6 鉴定程序  26-27
  3.2 结果  27-30
    3.2.1 贡嘎蝠蛾肠道菌群培养特性  27
    3.2.2 贡嘎蝠蛾幼虫肠道优势菌群的分离鉴定  27-29
    3.2.3 贡嘎蝠蛾幼虫肠道的菌群分析  29-30
  3.3 小结  30-31
4 贡嘎蝠蛾幼虫肠道菌群多样性的16SrDNA 的 PCR-DGGE 法研究  31-50
  4.1 引言  31
  4.2 材料与仪器  31-32
    4.2.1 贡嘎蝠蛾样品的采集及处理  31
    4.2.2 实验试剂  31
    4.2.3 引物序列  31-32
    4.2.4 试验仪器  32
  4.3 实验方法  32-41
    4.3.1 实验步骤  32
    4.3.2 肠道微生物总 DNA 的提取与纯化  32-33
    4.3.3 16SrDNA 片段的PCR 扩增  33-34
    4.3.4 扩增产物的DGGE 分离  34-36
    4.3.5 DGGE 胶上分离的16SrDNA 条带回收纯化  36-37
    4.3.6 16SrDNA 片段的PCR 再扩增和DGGE 再分离  37-39
    4.3.7 16SrDNA 片段的克隆和测序  39-41
  4.4 实验结果  41-49
    4.4.1 DNA 提取结果  41-42
    4.4.2 16SrDNA 片段的第一次扩增与DGGE 分离  42-43
    4.4.3 16SrDNA 片段的再扩增与DGGE 分离  43-45
    4.4.4 优势条带的克隆  45
    4.4.5 优势16SrDNA 条带测序结果与分析  45-49
  4.5 小结  49-50
    4.5.1 DGGE 分离出丰富的16SrDNA 条带  49
    4.5.2 不同微生物在肠道中菌群数量差异大  49
    4.5.3 贡嘎蝠蛾幼虫肠道细菌多样性丰富  49
    4.5.4 分子生物学鉴定结果与常规生理生化鉴定的优势菌群的差异  49-50
5 讨论与总结  50-56
  5.1 贡嘎蝠蛾幼虫肠道中微生物多样性丰富  50-51
  5.2 贡嘎蝠蛾幼虫肠道各种微生物数量差异大  51
  5.3 贡嘎蝠蛾幼虫肠道微生物的种类特殊  51-53
    5.3.1 蝠蛾肠道细菌都属低温菌  51
    5.3.2 蝠蛾肠道细菌大多为非典型菌群  51-53
    5.3.3 纯培养和分子生物学方法鉴定结果不一致  53
  5.4 研究方法的评价  53-55
  5.5 16SrDNA PCR-DGGE 分析方法的局限  55
  5.6 结论  55-56
致谢  56-57
参考文献  57-64
附录  64-67
独创性声明  67
学位论文版权使用授权书  67

贡嘎蝠蛾幼虫肠道细菌多样性分析

内容摘要

全文目录

相似论文