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扩展青霉脂肪酶的定点突变

作　者: 陈木妹
导　师: 林琳
学　校: 福建师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 扩展青霉碱性脂肪酶定点突变最适作用温度热稳定性
分类号: TQ925.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 133次
引　用: 3次
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内容摘要

本课题组已经克隆了扩展青霉碱性脂肪酶(Penicillium expansum lipase,PEL)基因,进行了全序列测定,并实现其在真核细胞毕赤酵母中的高效表达以及在酿酒酵母中的表达。为加深对该酶结构与功能关系的认识,改善其酶学性质,我们尝试用蛋白质工程方法对PEL进行改造,主要进行了如下几方面的工作: 采用重叠延伸PCR的方法获得突变基因PEL-D92P、PEL-G98A、PEL-N 148T、PEL-E113V、PEL-P163G、PEL-P163L、PEL-P163H、PEL-P163W、PEL-P163F、PEL-P163R,实现其在毕赤酵母GSll5中的表达,进行突变酶和野生型酶的某些性质比较。 1.突变体PEL-D92P-GS的最适作用温度提高5℃,热稳定性无明显变化。可能是脯氨酸的介入,降低无规则卷曲的柔性,使酶结构更加稳定,在高温条件下更适于与底物结合。 2.突变体PEL-G98A-GS对橄榄油水解能力发生急剧下降,几近为零。推测该点对维持酶的空间构象有重要作用。 3.突变体PEL-N148T-GS的比活约为野生型的115%,最适作用温度无明显改变,而热稳定性有所下降。可能是因为新引入的残基破坏了Asn与邻近的残基或是水形成氢键,从而导致了稳定性的降低。 4.突变体PEL—E113V—Gs的最适作用温度有所改善,热稳定性略有下降。推测可能是疏水性较强的氨基酸Val增加了酶分子的表面疏水性,从而提高酶分子的疏水性包装效率,同时突变对酶分子的空间构象影响较大,导致突变体稳定性的下降。 5.突变体PEK-P163G-GS、PEL-P163L-GS、PEL-P163H-GS、PEL-P163W-GS、PEL-P163F-GS、PEL-P163R-GS的表达蛋白量大大下降。

全文目录

内容提要  2-3
Abstract  3-6
序言  6-8
第一部分文献综述  8-26
  1．脂肪酶概述  8-9
  2．超嗜热菌(Hyperthermophile)热稳定性研究进展  9-19
    2．1 简介  9
    2．2 超嗜热酶生化与分子特性  9-10
    2．3 超嗜热酶的工业应用  10-11
    2．4 酶失活机制  11-12
    2．5 蛋白质热稳定性机制  12-19
  3．蛋白质工程策略提高提高热稳定性  19-24
    3．1 定点突变技术(Site-directed mutagenesis)  20-22
    3．2 定向进化技术  22-23
    3．3 定点突变与定向进化技术的结合  23-24
  4．其它促进蛋白质热稳定性的方法  24-26
    4．1 化学修饰  24-25
    4．2 稳定添加剂  25-26
第二部分材料与方法  26-40
  1．材料  26-28
  2．实验方法  28-40
    2．1 PEL-D92P定点突变  28-33
    2．2 PEL-G98A定点突变  33-34
    2．3 PEL-N148T定点突变  34-36
    2．4 PEL-E113V定点突变  36-37
    2．5 PEL-P163G、PEL-P163L、PEL-P163H、PEL-P163W、PEL-P163F、PEL-P163R定点突变  37-40
第三部分结果与分析  40-59
  1． PEL-D92P定点突变  40-45
    1．1 突变点的选择  40
    1．2 突变基因D92P的获得  40-41
    1．3 表达质粒pPIC3．5K-PEL-D92P的构建  41-42
    1．4 突变基因在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达  42-43
    1．5 PEL-D92P-GS最适反应温度和热稳定性的研究  43-45
  2． PEL-G98A定点突变  45-47
    2．1 突变点的选择  45
    2．2 突变基因G98A的获得  45-46
    2．3 突变基因在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达  46-47
  3． PEL-N148T定点突变  47-52
    3．1 突变点的选择  47-48
    3．2 突变基因N148T的获得  48-49
    3．3 突变基因在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达  49-50
    3．4 PEL-N148T-S最适反应温度和热稳定性的研究  50-52
  4． PEL-E113V定点突变  52-56
    4．1 突变点的选择  52
    4．2 突变基因E113V的获得  52-53
    4．3 突变基因在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达  53-54
    4．4 PEL-E113V-GS最适反应温度和热稳定性的研究  54-56
  5． PEL-P163G、PEL-P163L、PEL-P163H、PEL-P163W、PEL-P163F、PEL-P163R定点突变  56-59
    5．1 突变点的选择  56
    5．2 突变基因P163G、P163L、P163H、P163W、P163F、P163R的获得  56-57
    5．3 突变基因在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达  57-59
第四部分小结与讨论  59-62
参考文献  62-71
附录  71-73
中文摘要  73-76
致谢  76

扩展青霉脂肪酶的定点突变

内容摘要

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