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结缕草组织培养再生体系建立及转基因研究

作　者: 贺杰
导　师: 校现周；李瑞芬
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 植物学
关键词: 结缕草成熟胚组织培养植株再生遗传转化 bar基因 CBFI基因 IPT基因
分类号: S688.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 206次
引　用: 4次
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内容摘要

结缕草是一种被广泛应用的暖季型草坪草。它有着很多优良的特征:具有适应性广,抗旱性强、扩展力强、耐磨性和耐践踏性强、弹性高等特性,被广泛用于草坪、生态恢复、水土保持。但是结缕草绿色期短,抗寒性不太强。如果以传统育种方法与现代生物技术相结合尤其是现代生物技术的应用,将大大缩短育种周期。所以利用基因工程进行遗传改良的研究一直备受人们关注。我们在建立了高效的结缕草组培再生体系的基础之上,通过基因枪法和农杆菌介导法转化CBF₁和IPT基因,获得转化CBF₁基因的植株,为培育新品种打下基础。主要结果如下: 1.以结缕草成熟胚为外植体诱导愈伤组织的最适培养基:MS+2,4-D3.0mg/L+500mg/L+VB1（4.0mg/L）,诱导率43.20%; 2.继代培养最适合的培养基为MS+2,4-D（2mg/L）+6-BA（0.2mg/L）+ABA（0.2mg/L）胚性愈伤率28.4%, 3.分化培养基为MS+KT（2.0mg/L）+1.0（mg/L）+NAA（0.1mg/L）分化率56%; 4.生根培养基为1/2MS+NAA（0.1mg/L）,生根率100%; 5.以结缕草成熟胚诱导的愈伤组织为受体,采用基因枪轰击法和农杆菌介导法转化结缕草可获得转基因植株; 6.PCR检测表明外源基因CBF₁已整合到结缕草基因组DNA中; 7.RT-PCR检测表明目的基因已在结缕草转基因植株的转录水平表达; 8.农杆菌介导法基因CBF₁遗传转化率分别为0.26%

全文目录

第一章前言  8-20
  1.1 引言  8-9
  1.2 文献综述  9-16
    1.2.1 结缕草再生体系的建立  9-11
      1.2.1.1 以成熟胚为外植体的再生体系建立  10-11
      1.2.1.2 以幼穗、幼果、匍匐茎等为外植体的再生体系建立  11
    1.2.2 结缕草遗传转化  11-14
      1.2.2.1 原生质体转化法  11-12
      1.2.2.2 农杆菌介导转化法  12-13
      1.2.2.3 基因枪法  13-14
    1.2.3 结缕草应用生物技术培育新品种的研究  14-16
    1.2.4 应用转基因技术培育结缕草新品种所要解决的问题  16
      1.2.4.1 建立结缕草高效再生体系  16
      1.2.4.2 加强结缕草遗传转化系统的研究  16
  1.3 CBF1及PSAG12-IPT基因功能  16-18
  1.4 存在问题与展望  18
  1.5 本研究的目的和意义  18-20
第二章成熟胚为外植体的结缕草组织培养再生体系的建立  20-30
  2.1 材料与方法  20
    2.1.1 结缕草材料  20
  2.2 方法  20-21
    2.2.1 愈伤组织诱导  20
    2.2.2 愈伤组织的继代  20
    2.2.3 诱导分化  20-21
    2.2.4 植株再生  21
    2.2.5 植株移栽  21
  2.3 结果与分析  21-25
    2.3.1 结缕草愈伤组织诱导  21-23
      2.3.1.1 去除外稃与不去外稃成熟胚愈伤组织的比较研究  21
      2.3.1.2 不同2，4-D浓度对成熟胚愈伤组织诱导的影响  21-22
      2.3.1.3 脯氨酸对愈伤的作用  22-23
    2.3.2 不同ABA浓度继代培养基对结缕草成熟胚愈伤组织状态及分化能力的影响  23
    2.3.3 不同继代培养基对胚性愈伤组织发生的影响  23-24
    2.3.4 不同激素配比对胚性愈伤组织分化的影响  24-25
  2.4 问题与讨论  25-30
    2.4.1 结缕草种子的消毒与处理  25-26
    2.4.2 渗透压对愈伤组织诱导的影响  26
    2.4.3 脯氨酸愈伤组织诱导的影响  26-27
    2.4.4 结缕草愈伤组织继代中愈伤状态的调整  27
    2.4.5 关于外源激素的作用  27-29
      2.4.5.1 2，4-D  27-28
      2.4.5.2 6-BA  28
      2.4.5.3 ABA  28-29
    2.4.6 结缕草下胚轴建立植株再生体系的可能性  29-30
第三章结缕草遗传转化体系的建立及转耐寒、抗衰老基因研究  30-55
  3.1 基因枪转化法  30-41
    3.1.1 实验材料  30
    3.1.2 转化所用的重组质粒(图13)  30
    3.1.3 仪器设备和所用试剂  30-31
    3.1.4 培养基的名称及配方  31
    3.1.5 实验方法  31-37
      3.1.5.1 受体准备  31-34
      3.1.5.3 筛选的压的确定  34
      3.1.5.4 转化体筛选和植株再生  34
      3.1.5.5 转基因植株的分子检测(PCR及RT-PCR检测)  34-37
    3.1.6 结果与分析  37-38
      3.1.6.1 除草剂Glufosinate愈伤组织选择压的确定  37-38
      3.1.6.2 再生苗筛选压的确定  38
    3.1.7 问题与讨论  38-41
      3.1.7.1 结缕草的遗传转化受体  38
      3.1.7.2 影响结缕草基因枪法转化效率的  38-40
      3.1.7.3 共转化  40-41
  3.2 农杆菌介导法  41-50
    3.2.1 实验材料  41
    3.2.2 双元表达载体构建  41
    3.2.3 实验方法  41-46
      3.2.3.1 重组质粒DNA的提取和纯化(3 .1.6.1.1)  41-42
      3.2.3.2 P3301-IPT-Nos质粒转化农杆菌菌株  42-44
      3.2.3.3 农杆菌介导的结缕草的转化  44-45
      3.2.3.4 转化方法的优化  45-46
      3.2.3.5 转化体筛选和植株再生  46
      3.2.3.6 分子检测(PCR及RT-PCR检测)(同3.1.6.5)  46
    3.2.4 结果与分析  46-49
      3.2.4.1 构建双元表达载体P3301-IPT-Nos  46-47
      3.2.4.2 转化方法的优化  47-49
    3.2.5 农杆菌转化的抗性筛选及抗性愈伤组织分化苗  49-50
  3.3 转基因植株的分子检测结果  50-51
    3.3.1 转基因植株的PCR检测  50
    3.3.2 转基因植株的RT-PCR检测  50-51
  3.4 问题与讨论  51-55
    3.4.1 结缕草遗传转化中存在的问题  51-52
    3.4.2 提高转化效率的途径  52-53
      3.4.2.1 受体系统的完善  52
      3.4.2.2 AS(乙酞丁香酮)对转化的影响  52
      3.4.2.3 转化后恢复培养  52
      3.4.2.4 抗性愈伤的筛选  52-53
      3.4.2.5 提高抗性愈伤出苗率的措施  53
    3.4.3 基因枪法与农杆菌介导法的比较  53-55
第四章结论  55-61
附图说明  61-62
参考文献  62-68
缩写词  68-69
致谢  69

结缕草组织培养再生体系建立及转基因研究

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