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蛋白激发子PebC1及其复合体的表达纯化及初步结构解析

作　者: 李唐
导　师: 刘峥
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生化与分子生物学
关键词: PebC1蛋白 NAC蛋白家族蛋白质晶体学 X-射线衍射小角散射同源建模
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

蛋白激发子是一类源自真菌的能够诱导植物抗性的蛋白,具有促进植物代谢和生长,增强植物抗病、抗逆能力的活性。PebC1是本实验室从灰霉菌(Botrvtis cinerea)中分离得到的蛋白激发子(Zhang, et al., 2010),为了深入阐明PebC1的功能机理,本文对PebC1蛋白和能与其相互作用的灰霉菌βNAC蛋白分别用原核和真核表达系统进行了表达,并进一步进行了PebC1与bcβNAC复合体蛋白表达;在此基础上对表达蛋白进行纯化,对PebC1蛋白进行了初步结构解析。主要结果如下:1、通过对PebC1蛋白序列进行信息学分析,推测其是NAC(Nascent polypeptide Associated Complex)蛋白家族中αNAC同源蛋白。通过查询基因组数据库,得到灰霉菌中βNAC(bcβNAC)的编码基因egd1的基因序列,为深入研究PebC1蛋白的结构打下了基础。2、构建了PebC1及bcβNAC蛋白原核和真核表达系统,蛋白表达表明PebC1及bcβNAC蛋白适合用原核系统表达。将pebC1基因和egd1基因分别克隆到原核表达载体pET-30 His和pET-30 His+MBP上分别进行原核表达;同时将pebC1基因和egd1基因分别克隆到pFastBac His+GST载体上,得到重组的杆状病毒并分别进行真核表达。3、成功表达了PebC1和bcβNAC复合体蛋白。在原核表达系统中,将pebC1基因和egd1基因分别克隆到pETDuet-1双表达质粒的两个多克隆位点上,进行复核体蛋白表达,并得到超表达的复合体蛋白;在真核表达系统中,利用带有pebC1基因和egd1基因的两种重组病毒同时感染Hi5细胞进行真核表达,但由于PebC1被降解,不能表达复合体蛋白。4、完成对PebC1、bcβNAC以及复合体蛋白纯化条件的摸索。利用亲和层析、离子交换层析和分子筛层析的三步法进行纯化,摸索纯化条件,并得到高纯度的目的蛋白,为后续实验奠定基础。5、通过小角散射实验得到PebC1和bcβNAC的点阵结构模型。利用纯化的PebC1和bcβNAC蛋白进行小角散射实验,收集PebC1和带MBP标签的bcβNAC在小角区域的散射信号,对实验数据进行处理后得到蛋白的点阵模型。结合对PebC1的NAC和UBA结构域(Ubiquitin Associated domain)的同源建模结构的分析,表明PebC1呈S型对称分布,NAC二聚体形成凹陷的β桶状结构,UBA结构域悬挂在侧边。mbp-bcβNAC的点阵模型大体可分成两部分,Part 2呈直径50?的圆柱状;Part 1为厚度30?扁平状,同MBP蛋白的空间结构一致,由此推测MBP位于Part 1。bcβNAC的精细结构还需进一步实验测定。6、筛选得到复合体蛋白的初始结晶条件。采用气相扩散坐滴法,在20℃条件下筛选复合体蛋白的结晶条件,并在Hampton Research公司的Crystal Screen II的19#和MolecularDimensions MD1-02 34#条件下得到孪晶,为最终获得高质量单晶,用X射线衍射分析得到三维结构奠定了重要基础。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-14
第一章引言  14-29
  1.1 激发子的种类和性质  14-15
    1.1.1 非生物源激发子  14
    1.1.2 生物源激发子  14-15
  1.2 蛋白质的表达与分离纯化  15-18
    1.2.1 蛋白表达系统  15-16
    1.2.2 蛋白质的分离纯化方法  16-18
  1.3 蛋白质结构研究方法  18-27
    1.3.1 冷冻电子显微镜技术  18-19
    1.3.2 小角散射  19
    1.3.3 圆二色谱  19-20
    1.3.4 核磁共振  20
    1.3.5 X-射线晶体学  20-26
    1.3.6 同源建模  26-27
  1.4 研究目的和意义  27-28
  1.5 技术路线  28-29
第二章蛋白激发子PebC1 序列的信息学分析  29-31
  2.1 使用的软件和算法  29
  2.2 结果  29-31
第三章重组PebC1 及bcβNAC单体的表达与纯化  31-50
  3.1 实验材料、试剂和仪器  31
  3.2 重组PebC1 及bcβNAC单体的原核表达与纯化  31-37
    3.2.1 PebC1 及bcβNAC原核表达载体的构建  33-35
    3.2.2 PebC1 及bcβNAC的原核表达  35
    3.2.3 PebC1 的纯化  35-36
    3.2.4 bcβNAC的纯化  36
    3.2.5 目的蛋白的SDS-PAGE电泳检测  36-37
  3.3 重组PebC1 及bcβNAC单体的真核表达与纯化  37-41
    3.3.1 重组pFastBac donor载体的构建  37-39
    3.3.2 重组Bacmid质粒的制备  39-40
    3.3.3 转染及病毒扩增  40
    3.3.4 表达  40-41
    3.3.5 纯化  41
    3.3.6 目的蛋白的SDS-PAGE电泳检测  41
  3.4 结果  41-48
    3.4.1 原核表达系统  41-46
    3.4.2 真核表达系统  46-48
  3.5 讨论  48-50
第四章重组PebC1 与bcβNAC复合体蛋白的表达与纯化  50-58
  4.1 原核表达系统表达重组PebC1 与bcβNAC复合体蛋白  50-52
    4.1.1 实验材料与试剂  50
    4.1.2 bcβNAC重组载体的构建  50-51
    4.1.3 PebC1 重组载体的构建  51-52
    4.1.4 复合体蛋白的原核表达  52
    4.1.5 复合体蛋白的纯化  52
    4.1.6 目的蛋白的SDS-PAGE电泳检测  52
  4.2 真核表达系统表达重组PebC1 与bcβNAC复合体蛋白  52-53
    4.2.1 实验材料和试剂  52
    4.2.2 病毒的制备  52
    4.2.3 复合体蛋白的真核表达  52-53
    4.2.4 复合体蛋白的纯化  53
    4.2.5 目的蛋白的SDS-PAGE电泳检测  53
  4.3 结果  53-57
    4.3.1 重组PebC1 和bcβNAC复合体原核表达系统的表达及纯化  53-56
    4.3.2 重组PebC1 和bcβNAC复合体真核表达系统的表达及纯化  56-57
  4.4 讨论  57-58
第五章 PebC1 及其复合体蛋白结构的初步解析  58-68
  5.1 复合体蛋白晶体生长条件的研究  58-59
    5.1.1 材料和试剂  58
    5.1.2 晶体生长条件筛选  58
    5.1.3 结晶条件的优化  58
    5.1.4 结果  58-59
    5.1.5 讨论  59
  5.2 小角散射  59-63
    5.2.1 实验材料和器材  59
    5.2.2 样品的预处理与上样  59-60
    5.2.3 样品检测  60
    5.2.4 数据处理  60-61
    5.2.5 结果  61-63
    5.2.6 讨论  63
  5.3 同源建模  63-66
    5.3.1 模板的选择  63-64
    5.3.2 模板间的比对  64
    5.3.3 序列与模板的比对  64
    5.3.4 建模  64
    5.3.5 模型的检查和评价  64-66
  5.4 模型的分析  66-67
  5.5 讨论  67-68
第六章全文总结  68-69
参考文献  69-74
附录一仪器设备  74-75
附录二试剂  75-76
附录三溶液及配置方法  76-78
致谢  78-79
作者简历  79

蛋白激发子PebC1及其复合体的表达纯化及初步结构解析

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