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腮腺炎病毒F蛋白七肽重复序列的结构生物学研究

作　者: 刘月永
导　师: 冯明光；田波；高福
学　校: 浙江大学
专　业: 微生物学
关键词: 腮腺炎病毒MuV 融合蛋白F 七肽重复序列HR 融合机制
分类号: R34
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
下　载: 71次
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内容摘要


腮腺炎病毒（MuV）同其他囊膜病毒相似，在融合蛋白（F）中具有两个七肽重复序列结构域（HR）。有关其他囊膜病毒F蛋白的研究表明，HR区在F蛋白介导的病毒侵染中起着至关重要的作用，在结合蛋白或结合亚基的协助作用下，两段HR结构域的构像发生变化形成热稳定的富含α螺旋的发夹异源三聚体结构，并由此得到一个共同的融合机制。但目前并不清楚MuV是否有类似于其他囊膜病毒的侵染机制。 本研究构建了HR区（HR1、HR2和2-Helix）的重组载体，并在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达了HR1、HR2和2-Helix。GST融合的HR1、HR2和2-Helix单体蛋白都以可溶形式表达，利用亲和层析及凝胶过滤层析纯化获得了高纯度的目的蛋白。经pull-down实验，初步证实HR1和HR2之间存在相互作用，HR1和HR2的混合物在凝胶过滤层析中以聚体形式存在。HR1／HR2和2-Helix的化学交联实验表明，等摩尔的HR1和HR2可形成异源三聚体，其中2-Helix蛋白随着交联剂浓度的增加，呈现明显的单体和聚体的浓度梯度；HR1／HR2蛋白由于浓度较低虽未见清晰的单体和聚体的浓度梯度，但仍可看到明显的异源三聚体。凝胶过滤层析也证实了这一结果，两者在同一位置出峰，且在分子量为52 kDa和14.4 kDa的出峰位置之间，显示其以聚体形式存在。质谱分析结果显示，2-Helix蛋白分子量为11.7 kDa，HR1为7.1 kDa，HR2为4.7 kDa，2-Helix和HR1／HR2三体分子量分别为35.1 kDa和35.4 kDa，与凝胶过滤层析结果相对应。圆二色谱分析结果表明，单独的HR1以α螺旋结构存在，而HR2则以无规卷曲存在，当两者等摩尔混合后，α螺旋含量明显增加。2-Helix同样具有典型的α螺旋结构。2-Helix和HR1／HR2三体相当稳定，Tm达到76℃，而且这种结合是特异的，高温变性后的蛋白经低温长时间放置后能够大部分复性，仍然呈现较高含量的α螺旋结构。用晶体生长条件筛选试剂盒（Crystal Screen Ⅰ and Ⅱ，Hampton Research，Riverside，CA，USA）对2-Helix蛋白晶体的生长条件进行初选，经过优化最后在15％PEG 8000、1.0 M Li2SO4缓冲液长出可以进行衍射的晶体。通过应用程序AMORE，以SV5 F蛋白N1／Cl三聚体晶体结构（PDB code：1SVF）为模型，利用分子置换的方法对2-Helix的晶体结构进行解析，得到了与SV5、RSV和NDV核心结构相似的六螺旋束，显示MuV可能具有与上述蛋白相似的融合侵染机制。

全文目录


致谢  5-8
中文摘要  8-9
英文摘要  9-11
1 囊膜病毒融合蛋白研究现状及文献评述  11-31
  1.1 腮腺炎病毒概述  11
  1.2 囊膜病毒融合的分子机制  11-20
    1.2.1 病毒囊膜融合蛋白的一些基本特征  12-13
    1.2.2 流感病毒HA和HIV-1Env蛋白  13-20
  1.3 共同融合机制  20-22
  1.4 副粘病毒的融合机制  22-29
    1.4.1 副粘病毒简介  22-24
    1.4.2 副粘病毒的融合蛋白  24-26
    1.4.3 副粘病毒的融合机制  26-29
  1.5 存在问题、研究内容与目标  29-31
2 腮腺炎病毒HR1、HR2及2-Helix基因载体构建  31-37
  2.1 材料与方法  31-35
    2.1.1 质粒与菌株  31
    2.1.2 HR基因的引物设计  31
    2.1.3 构建载体  31-35
  2.2 结果与分析  35-37
    2.2.1 基因载体构建  35
    2.2.2 重组质粒的双酶切鉴定和测序  35-36
    2.2.3 重组质粒的表达鉴定  36-37
3 HR1、HR2及2-Helix蛋白的表达和纯化  37-41
  3.1 材料与方法  37-38
    3.1.1 重组载体在大肠杆菌中的表达  37
    3.1.2 表达蛋白产物的纯化  37-38
  3.2 结果与分析  38-41
    3.2.1 pGEX-HR1、pGEX-HR2、pGEX-2-Helix都以可溶性蛋白的形式表达  38-39
    3.2.2 HR1、HR2和2-Helix蛋白的初步纯化  39
    3.2.3 HR1和HR2相互作用分析  39-40
    3.2.4 2-Helix与HR1／HR2蛋白以多聚体形式存在  40-41
4 腮腺炎病毒融合蛋白核心结构的二级结构分析  41-46
  4.1 材料和方法  41
    4.1.1 质谱分析  41
    4.1.2 化学交联  41
    4.1.3 圆二色谱分析  41
  4.2 结果与分析  41-46
    4.2.1 2-Helix和HR1／HR2蛋白以三聚体的形式存在  41-44
    4.2.2 2-Helix和HR1／HR2的α螺旋结构  44-46
5 蛋白2-Helix的结晶和结构解析  46-49
  5.1 材料与方法  46
    5.1.1 晶体生长条件的筛选  46
    5.1.2 晶体X射线衍射数据的收集和分析  46
    5.1.3 晶体结构的解析  46
  5.2 结果与分析  46-49
    5.2.1 蛋白2-Helix的结晶  46-47
    5.2.2 2-Helix蛋白晶体X射线衍射数据的分析  47-49
6 问题与讨论  49-53
参考文献  53-65
附录1: MuV-HR1测序图  65-66
附录2: MuV-HR2测序图  66-67
附录3: MuV-2-Helix测序图  67-68
附录4: MuV-2-Helix mutation测序图  68-69
附录5: 在读期间发表的研究论文  69

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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