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成人生精小管cDNA表达文库构建及小管生精细胞的分离

作　者: 李鑫
导　师: 章涛；江一平
学　校: 福建医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 生精小管 cDNA质粒表达文库表达序列标签生精细胞非连续Percoll梯度法
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

目的:1.构建成人生精小管cDNA表达文库;2.利用复合酶消化合并非连续Percoll梯度法从成人生精小管中分离纯化生精细胞。方法:本研究以成人生精小管为研究对象:1.通过Trizol法,从成人生精小管中提取总RNA,经Oligo(dT)-纤维素法分离纯化mRNA,逆转录生成双链cDNA,克隆至表达质粒载体pSPORT ?,经高效电转化至DH5a大肠杆菌中,构建成人生精小管cDNA质粒表达文库,同时对二个表达序列标签(EST)进行分析。2.以复合酶消化结合非连续Percoll梯度离心,尝试从成人生精小管中快速分离纯化生精细胞。结果:1. cDNA文库的容量大致为1.1×106 cfu,重组率约为93%,插入片段的平均长度约1.3kb,表明构建文库的质量较好;2.其中一条EST 同促性腺激素释放激素受体2(gonadotropin-releasing hormone receptor 2)在蛋白水平具有31%的同源性,而另外一条EST在蛋白水平与钙调蛋白存在26%的同源性,发现其含有一段编码128个氨基酸的开放阅读框并可能存在一个保守结构域(conserved domains,CD),与钙调蛋白及其相关蛋白家族的结构域(151个氨基酸构成)存在60.9%的相关性,上述ESTs GeneBank登录号为: CN445900, CN445899;3.通过合理的复合酶消化并设置22%-30%-35%-40%四层非连续Percoll梯度分离发现:22%梯度处主要为精子细胞,纯度为91.7%;30%梯度处细胞密度最大(P<0.05),富含各级未成熟的生精细胞,含量为88.6%。结论:1.成功构建了成人生精小管cDNA质粒表达文库;2.发现一条可能代表人促性腺激素释放激素受体同源蛋白的EST,另一所编码的蛋白考虑为钙<WP=5>调素的同源蛋白;3.将复合酶消化合并非连续Percoll梯度法应用于分离成人生精小管精子细胞和未成熟生精细胞。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
引言  8-10
实验一. 成人生精小管 cDNA 表达文库的构建  10-42
  实验设计  10-11
  材料与仪器  11-14
  实验方法  14-22
  结果  22-27
  讨论  27-32
  实验一附图  32-42
实验二. 非连续 Percoll 梯度法分离小管生精细胞  42-50
  实验设计  42
  材料与仪器  42-43
  实验方法  43-44
  结果  44-46
  讨论  46-48
  实验二附图  48-50
参考文献  50-52
综述  52-57
参考文献  57-59
致谢  59

成人生精小管cDNA表达文库构建及小管生精细胞的分离

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