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云南少数民族地区乙型肝炎病毒功能基因变异的研究

作　者: 华占楼
导　师: 连中启
学　校: 第三军医大学
专　业: 消化内科学
关键词: 少数民族 HBV 少数民族CHB患者 核苷酸测定 功能基因变异 SDS-PAGE Western blot
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要


本文采用分子生物学技术对云南少数民族地区34例慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者（17例不同的少数民族患者与17例汉族患者）乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）进行了功能基因变异及临床的研究，旨在为阐明HB慢性化、重型化的分子机制，寻找安全有效的针对性防治乙肝新措施，设计研发新型乙肝疫苗提供理论依据，这对于提高我国少数民族人民的健康水平具有极其重要的意义。本研究首先应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）对云南少数民族地区34例CHB患者HBV pre S2／S和C基因进行扩增，然后将扩增产物克隆到载体pBS（pBluescriptⅡ SK，pBS）上，进行核苷酸测序分析和临床研究，最后将目的基因编码序列克隆到原核表达载体pλPR上并在大肠杆菌中进行表达，应用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和蛋白免疫印迹分析（Western blot）鉴定。发现34例患者HBV均扩增出preS2／S基因全长846bp，GC含量占49.1％，编码281个氨基酸（amino acid，aa）；C基因全长552bp，GC含量占46.1％，编码183个aa。通过与GenBank中adr、adw、ayr和ayw四种亚型比较，确证34例患者HBV基因序列与ayw1亚型序列具有高度同源性，分别为preS2／S基因氨基酸同源性为97.5％～98.6％，C基因氨基酸同源性为94.5％～97.8％。17例不同的少数民族CHB患者与17例汉族CHB患者HBV preS2／S和C功能基因变异比较，差异无显著性（P＞0.05）。所有病例HBV S基因抗原决定簇在核苷酸（nucleotide，nt）518～520为AGA，nt 632～634为AAA，则对应的第122位aa均为精氨酸（AGA），第160位aa均为赖氨酸（AAA），可以确定云南少数民族地区不同民族HBV流行株为ayw1亚型（属B基因型）。34例患者HBV C基因在T细胞和B细胞表位存在27～63、80～110、135～153位间氨基酸聚集性变异，其中29例CHB患者HBV C基因在T细胞表位由于nt 1979A→G，nt 2012T→A，nt 20886→T，nt 2304C→A和nt 2339A→G的变异，分别引起V27、N38、V63、Q135和A147的氨基酸替代，而另外5例慢性重型乙型肝炎HBV C基因在B细胞表位由于nt 2159A→G，nt 2189A→C的变异，分别引起G87、L97的氨第三军医大学硕卜学位论文基酸替代。本研究将所得到的目的基因构建成两个重组原核表达质粒p入PR一525和p人PR一C，经在大肠杆菌中进行表达后，SDS一PAGE显示，preSZ/S基因和C基因编码蛋白相对分子质量分别为31000和21000。通过Western blot分析发现，目的蛋白能够被特异性抗体所识别，证实目的蛋白具有HBv preSZ/S和C抗原的表位，说明表达的目的蛋白没有影响抗原空间结构的正确形成，这证明获得的目的蛋白具有免疫原性。上述研究结果证实中国云南少数民族地区不同民族HBV流行株为aywl亚型，属B基因型，并且发现这个地区不同的少数民族CHB患者与汉族CHB患者HBV功能基因差异无显著性（P>0.05），表明HBV不具有种族差异，与不同民族无相关性。研究还证实云南少数民族地区乙肝患者HBVC基因在T细胞和B细胞表位存在氨基酸聚集性变异，与CHB肝脏损害持续存在和病变加重有相关性。HBV功能基因变异可能与HBV致病分子机制和改变宿主免疫应答及其产生耐药性有相关性。Westernblot分析证实云南少数民族地区不同民族CHB患者HBV preSZ/S和C基因编码蛋白具有抗原性，并证明云南少数民族CHB患者HBV在S基因的121一147位aa存在CRTCTTPAQGTSMFPSCCCTKPMDGNC表位，在C基因的75一83位aa存在NLEDPASRE表位和107一118位aa存在CLTFGRETVLEY表位。

全文目录


前言  6-11
英文摘要  11-13
中文摘要  13-15
第一部分 云南少数民族地区不同民族乙肝患者HBV preS2／S和C基因的分子克隆  15-26
  材料  15-17
  方法  17-23
  结果  23-24
  讨论  24-26
第二部分 云南少数民族地区不同民族乙肝患者HBV preS2／S和C基因的序列分析  26-42
  材料  26
  方法  26-28
  结果  28-38
  讨论  38-42
第三部分 云南少数民族地区不同民族乙肝患者HBV preS2／S和C基因在大肠杆菌中的表达  42-56
  材料  42-43
  方法  43-50
  结果  50-54
  讨论  54-56
参考文献  56-60
综述  60-74
主要研究成果  74-75
在校期间发表论文情况  75-76
致谢  76-77

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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