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应用噬菌体展示技术筛选与胶质瘤细胞特异性结合的短肽

作　者: 王冰
导　师: 钟雪云
学　校: 暨南大学
专　业: 病理学
关键词: 胶质瘤噬菌体展示短肽全细胞筛选决定簇靶向药物
分类号: R739.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

目的：利用噬菌体随机十二肽库筛选出能够和胶质瘤细胞系SWO-38的两株具有不同生物学特性克隆亚系Z1和Z2分别特异性结合的短肽序列，分析序列组成，找出能够和胶质瘤细胞特异性结合的配体蛋白质及分析这些蛋白与细胞结合的氨基酸决定簇位点及方式，为研究短肽在肿瘤靶向药物开发和肿瘤特异性定位标志方面提供研究资料。方法：用噬菌体随机十二肽库对体外培养的人胶质瘤细胞Z1和Z2分别进行5轮全细胞筛选。从每种细胞筛选后的两部分噬菌体库中，即细胞表面结合部分和内化入细胞部分，分别随机挑选10个以上噬菌体单克隆进行测序。同时对随机挑选的噬菌体单克隆进行与野生型VcsMl1噬菌体的竞争结合实验及对HepG-2、MCF-7、JEC、3T3、C2C12五种不同组织来源细胞系的特异性结合分析，利用免疫荧光方法检测噬菌体克隆能否与细胞结合及结合部位。在测序结果中找出及分析出现频率高的短肽序列和其可能的蛋白质结构。结果：经过5轮全细胞筛选后，各部分噬菌体库的回收量均可达到10~7～10~8数量级，且竞争结合分析及细胞特异性结合分析均显示筛选后的噬菌体克隆及噬菌体库对胶质瘤细胞具有明显的特异性紧密结合。测序结果显示有三条序列出现频率较高，其中序列-SLHSKAYERPLS-和-TITNANKPSITL-为两株细胞所共有，而序列-STKVLPVHTRPA-为细胞Z1所独有并只结合在Z1细胞表面。细胞免疫荧光可见具有展示短肽的噬菌体克隆可大量聚集结合在胶质瘤细胞表面，并在细胞内部呈现点簇状聚集，发出绿色荧光。结论：利用噬菌体肽库对肿瘤细胞系进行全细胞筛选可得到与肿瘤细胞能特异性结合的短肽序列，这些短肽片段可能为与肿瘤细胞表面特异及过度表达的一些受体相结合的配体蛋白上的决定簇序列，并可能通过受体介导的方式被内吞进细胞内。

全文目录

中文摘要  6-7
英文摘要  7-8
前言  8-18
  一、寻找脑胶质瘤治疗的新方法  8-10
  二、噬菌体随机肽库展示技术  10-18
    1 噬菌体展示技术的发展和意义  10-11
    2 噬菌体随机肽库展示技术的原理  11-14
    3 噬菌体随机展示肽库的筛选流程  14-16
    4 噬菌体随机肽库展示技术在全肿瘤细胞筛选中的应用  16-17
    5 本研究的主要研究内容和意义  17-18
材料与方法  18-28
  第一部分主要材料及试剂  18-23
    一、主要实验材料及试剂  18-19
    二、主要试剂的配置方法  19-21
    三、主要实验仪器及设备  21-23
  第二部分实验方法  23-28
    一、技术路线  23-24
    二、细胞培养  24
    三、噬菌体肽库对胶质瘤细胞的筛选  24-26
    四、野生型M13噬菌体VcsM13的竞争结合实验  26
    五、噬菌体对Z1和Z2细胞结合的特异性分析  26-27
    六、细胞免疫荧光分析  27
    七、测序及序列分析  27
    八、统计学分析  27-28
实验结果  28-51
  一、 5轮噬菌体肽库筛选后的计数结果及分析  28-31
  二、野生型噬菌体VcsM13的竞争结合实验结果  31-35
  三、 5轮筛选后的噬菌体库与胶质瘤细胞株结合的特异性分析  35-36
  四、细胞免疫荧光  36-37
  五、测序结果及序列分析  37-51
讨论  51-62
  一、噬菌体随机肽库展示技术在肿瘤全细胞筛选中的应用  51-54
  二、短肽序列的功能及结构预测  54-59
  三、噬菌体随机肽库展示技术在多肽药物的开发中的应用  59-62
结论  62-63
参考文献  63-68
附录  68-74
英文缩略词  74-75
研究生在读期间发表的文章  75-76
致谢  76

应用噬菌体展示技术筛选与胶质瘤细胞特异性结合的短肽

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