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两种糖基转移酶（ppGalNAcT2及β3GnT8）与人脑胶质瘤细胞株U251相关性探索研究

作　者: 杨玲焰
导　师: 吴士良；刘珺；徐岚
学　校: 苏州大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: ppGalNAc-T2 β3GnT8 胶质瘤 侵袭转移 MMPs
分类号: R341
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的:探讨两种糖基转移酶(ppGalNAcT2及β3GnT8)对胶质瘤细胞U251侵袭转移的影响。方法:(1)将ppGalNAcT2及β3GnT8的真核表达正义载体及空载体、RNA干扰载体及其对照载体通过脂质体转染入胶质瘤细胞U251,并通过G418筛选出稳定细胞株。(2)荧光显微镜观察转入荧光载体的细胞株,RT-PCR检测ppGalNAcT2的表达;流式细胞术及MTT检测ppGalNAcT2对细胞周期及增殖的影响;划痕修复实验检测各组细胞的迁移能力差异;采用RT-PCR方法检测各组细胞MMP-2、TIMP-2 mRNA水平表达变化。(3)通过激光共聚焦显微镜观察检测GFP蛋白和β3GnT8的蛋白表达;RT-PCR及western blotting方法检测细胞β3GnT8 mRNA及蛋白水平表达变化;集落形成实验检测β3GnT8对单细胞形成集落能力的影响;划痕修复实验及Boyden小室检测细胞迁移及侵袭能力差异;采用RT-PCR及western blotting方法检测各组细胞MMP-2、TIMP-2 mRNA及蛋白水平表达变化。结果:(1)通过荧光显微镜观察、RT-PCR、western blotting及免疫荧光检测,载体成功转入细胞,得到稳定转染细胞株;(2)流式细胞术及MTT实验检测发现ppGalNAc-T2与细胞的周期时相及增殖能力间不存在显著相关性;划痕结果显示,ppGalNAc-T2上调组细胞迁移能力随ppGalNAc-T2的上调而减弱,干扰组划痕修复较快,其他对照组相近;RT-PCR检测发现随着ppGalNAc-T2的增高,MMP-2降低,而TIMP-2升高;(3)集落形成实验显示:与对照组相比,β3GnT8上调组单个细胞集落形成能力强,干扰组弱;划痕结果显示,β3GnT8上调组细胞迁移能力增强,而干扰组细胞划痕修复较慢。与划痕结果相对应的,通过Boyden小室实验发现,与对照组相比,β3GnT8上调组细胞的穿膜能力增强,细胞侵袭能力较强,而下调组穿膜率较对照组都低,侵袭能力弱;RT-PCR及western blotting检测发现随着β3GnT8表达的增高,MMP-2在mRNA水平及蛋白水平也相应升高,而TIMP-2表达水平未有显著改变。结论:(1)成功构建ppGalNAc-T2及β3GnT8上调及下调细胞株。(2)通过流式细胞术及MTT实验检测发现,ppGalNAc-T2与细胞周期及增殖能力间无显著相关性;划痕实验显示ppGalNAc-T2抑制细胞的划痕修复;进一步通过RT-PCR检测发现,ppGalNAc-T2与MMP-2呈负相关,与TIMP-2呈正相关。(3)细胞集落形成实验显示β3GnT8能促进集落形成;划痕修复及Boyden侵袭小室实验发现,β3GnT8促进细胞的划痕修复,同时促进细胞侵袭;进一步通过RT-PCR及western blotting检测显示,β3GnT8与MMP-2呈正相关,而与TIMP-2间无统计学意义。综上所述,我们推测这两种糖基转移酶ppGalNAc-T2及β3GnT8可能与胶质细胞的侵袭转移密切相关。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-10
前言  10-21
  1 糖组学  10
  2 糖基转移酶  10-11
  3 糖蛋白与肿瘤关系  11-12
  4 侵袭转移相关基因 MMPs 及 TIMPs  12-13
  5 神经胶质瘤的侵袭转移特性  13-15
  6 糖基转移酶与肿瘤  15-16
  参考文献  16-21
第一部分 ppGalNAc-T2 高/低表达 U251 细胞株的建立及其与侵袭转移相关性研究  21-38
  1 引言  21
  2 材料和方法  21-27
    2.1 材料  21-23
    2.2 方法  23-27
  3 结果  27-32
    3.1 载体酶切产物电泳图  27
    3.2 载体测序结果  27-28
    3.3 荧光检测  28
    3.4 RT-PCR 检测ppGalNAc-T2、MMP-2、TIMP-2 的表达  28-30
    3.5 FCM 检测各组细胞周期  30
    3.6 MTT 检测细胞增殖性能  30-31
    3.7 划痕修复  31-32
  4 讨论  32-35
  5 参考文献  35-38
第二部分 β3GnT8 高/低表达U251 细胞株的建立及其与侵袭转移相关性研究  38-56
  1 引言  38
  2 材料和方法  38-43
    2.1 材料  38-40
    2.2 方法  40-43
  3 结果  43-48
    3.1 载体酶切与PCR 产物电泳图及测序图  43-44
    3.2 载体测序结果  44-45
    3.3 RT-PCR 筛选β3GnT8 稳定转染高效正义及干扰细胞株  45
    3.4 免疫组化检测细胞β3GnT8 蛋白表达及细胞形态  45-46
    3.5 细胞集落形成能力  46
    3.6 RT-PCR 及western blotting 检测β3GnT8 的表达  46-47
    3.7 β3GnT8 促进细胞体外侵袭转移  47
    3.8 β3GnT8 对细胞 MMP-2 及TIMP-2 表达的影响  47-48
  4 讨论  48-52
  5 参考文献  52-56
全文小结  56-57
综述  57-65
攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文  65-66
缩略词表  66-68
致谢  68-69

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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