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水稻正向控制系统获得抗性的调节基因的功能鉴定

作　者: 梁淑家
导　师: 冯家勋
学　校: 广西大学
专　业: 微生物学
关键词: NPR1基因根癌农杆菌介导的转化系统获得抗性水稻水稻黄单胞菌水稻致病变种
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

NPR1基因是Cao等于1997年用图位克隆法从拟南芥中克隆得到的控制系统获得抗性的重要调节基因，在诱导条件下，NPR1基因的表达提高，NPR1蛋白被激活，从而诱导下游一系列的病程相关基因的表达。NPR1基因在拟南芥中过量表达只是提高了植物的抗病性，但对植物生长等无不良影响。本研究将从水稻恢复系桂99中克隆到的拟南芥NPR1基因的同源基因以反义方向连接到载体pCAMBIA1301-35SN上构建得到水稻表达载体，用根癌农杆菌介导法将该反义基因导入到桂99中，经过潮霉素筛选、分化获得了7株潮霉素抗性植株。PCR检测及对PCR产物测序表明7株潮霉素抗性植株中有6株为转该反义基因的植株。用水稻黄单胞菌水稻致病变种中国菌株13751剪叶接种这些转基因植株，14天后测量病斑长度，结果6株转基因植株的病斑长度显著长子对照的病斑长度，说明该反义基因的表达引起了水稻抗病性降低，该基因是水稻系统获得抗性的正调节基因。

全文目录

第一章前言  8-23
  1．根癌农杆菌转化系统的作用机理  8-10
    1．1 Ti质粒的结构与功能  8-10
  2． Ti质粒衍生的载体系统  10
    2．1 目的基因克隆载体  10
    2．2 中间载体和卸甲载体  10
  3．植物基因转化载体系统  10-11
    3．1 一元载体  10-11
    3．2 双元载体  11
  4．根癌农杆菌对单子叶植物的转化  11-12
  5．植物抗病分子机理  12-17
    5．1 植物的抗病反应  13-14
    5．2 植物抗病基因的克隆  14
    5．3 植物抗病基因的结构、功能及其作用机制  14-16
    5．4 植物抗病过程的信号传导  16-17
  6．植物系统获得抗性  17-19
    6．1 基本概念及特征  17-18
    6．2 水杨酸在SAR中的信号传导  18
    6．3 涉及SAR信号传导途径和SAR反应的突变体  18-19
  7．反义RNA技术  19-21
    7．1 反义RNA的作用机理  20
    7．2 反义RNA的应用  20-21
  8．拟南芥NPR1基因及本研究的目的意义  21-23
    8．1 拟南芥NPR1基因  21-22
    8．2 本研究的目的意义  22-23
第二章材料与方法  23-37
  1．菌株和质粒  23
  2．水稻品种  23
  3．培养基及培养条件  23-25
  4．菌株培养条件及保存  25-26
  5．抗生素及其使用浓度  26
  6．常用溶液及缓冲液  26-27
  7．质粒DNA的提取  27-28
    7．1 快速碱裂解少量质粒DNA的提取  27
    7．2 质粒DNA的大量提取  27-28
  8． DNA沉淀  28
  9． DNA溶液中蛋白质及RNA的去除  28
  10．植物总DNA的提取  28-29
    10．1 植物总DNA的大量提取  29
    10．2 植物总DNA的微量提取  29
  11． DNA的酶切、电泳及DNA片段浓度大小测算  29-30
    11．1 DNA的酶切  29-30
    11．2 DNA的酶切、电泳及DNA片段浓度、大小测算  30
  12． DNA片段的回收  30-31
    12．1 低熔点琼脂糖凝胶法  30
    12．2 电透析法回收DNA片段  30-31
  13．载体的脱磷酸化处理  31
  14． DNA连接  31-32
  15．质粒DNA的电脉冲转化  32
  16．三亲本接合  32-33
  17．水稻的遗传转化过程  33-34
    17．1 组织培养和转化的培养基  33
    17．2 水稻种子的灭菌  33
    17．3 愈伤组织的继代  33
    17．4 水稻转化的基本路线  33-34
  18．根癌农杆菌对头孢噻肟钠（Cef）敏感性测定  34
  19．桂99愈伤组织对潮霉素（Hyg）的敏感性测定  34-35
  20． PCR检测  35
    20．1 引物序列  35
    20．2 PCR反应体系  35
    20．3 反应参数  35
  21． PCR产物测序  35-36
  22．水稻抗病性检测  36-37
第三章结果与分析  37-53
  1．表达载体的构建  37-41
    1．1 水稻反义表达载体pGXN5310的构建  37-40
    1．2 水稻NPR1同源基因的反义表达载体向农杆菌EHA105的导入  40-41
  2．水稻NPR1基因反义表达载体对桂99愈伤组织的转化及再生  41-46
    2．1 转化受体的准备  41-42
    2．2 头孢噻肟钠（Cef）抑制农杆菌的有效浓度的测定  42
    2．3 愈伤组织对潮霉素的敏感性  42-43
    2．4．根癌农杆菌对桂99愈伤组织的转化和筛选  43-45
    2．5 水稻植株再生  45-46
  3．再生植株的鉴定和转化效率的分析  46-53
    3．1 转化效率的分析  46-47
    3．2 转基因植株的PCR检测  47-51
    3．3 转基因植株的抗病性鉴定  51-53
第四章讨论  53-55
  1．根癌农杆菌介导的水稻转化  53-54
  2．桂99转反义NPR1基因植株的表现型  54-55
参考文献  55-62
致谢  62

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