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重组人粒细胞集落刺激因子生产工艺的研究

作　者: 王海波
导　师: 耿信笃
学　校: 西北大学
专　业: 分析化学
关键词: 重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF) 正交实验 高密度发酵 流加培养 重组大肠杆菌 分离纯化 蛋白复性 高效液相色谱 基因工程
分类号: TQ920
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要


本文包括六个章节。从发酵培养基、摇瓶培养条件、发酵罐培养条件三个方面系统的研究了重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的高密度发酵及放大工艺，每升发酵液中rhG-CSF的产量达到439mg。并研究了rhG-CSF的分离纯化的条件，一步疏水色谱分离纯化，使rhG-CSF的纯度从53．0％增加到97．8％，质量回收率达到24．0％。 1．重组大肠杆菌DH5α／pBV220发酵培养基的研究 在摇瓶中对工程菌DH5α／pBV220的发酵培养基进行了研究，从几种常用的细菌培养基中筛选适合工程菌DH5α／pBV220表达rhG-CSF的培养基，确定出M9培养基为基本培养基。利用单因子实验对M9培养基中的碳源和氮源种类进行了筛选，确定出适合工程菌DH5α／pBV220生长的碳源种类和氮源种类。利用正交试验筛选出工程菌生长的优化培养基配方，此培养基记为M9Ⅲ培养基。 2．重组大肠杆菌DH5α／pBV220摇瓶发酵的研究 对工程菌DH5α／pBV220在摇瓶发酵中的培养温度、发酵液pH值、溶氧、诱导时机、种子菌龄、接种量、诱导维持时间等工艺条件进行研究，确定出摇瓶发酵的最优培养条件。由实验结果得出，摇瓶培养工程菌的最优条为：温度为30℃，发酵液初始pH值为7．0～7．2，选择40％的装液量，摇床转速控制在220r左右，种子菌龄的OD600为1．5时接种为佳，选择菌体在对数生长前期(OD600=1．0)进行诱导4h可获得最佳效果。使用优化的M9Ⅲ培养基，在优化的培养条件下，摇瓶中rhG-CSF的表达量为36．5％，干重为4．45g／L。 3．重组大肠杆菌DH5α／pBV220在5L发酵罐上的间歇培养 以摇瓶发酵的研究结果为基础，在发酵罐上研究溶氧(dissolve oxygen)、诱导时机、接种量等因素对DH5α／pBV220工程菌分批发酵及补料分批发酵的影响。 首先在5L发酵罐中，对工程菌DH5α／pBV220间歇培养时，是否在培养基中添加微量元素和维生素等工艺条件进行了优化，确定出间歇培养的最优培养条件。在 SL发酵罐最优培养条件下，rhG（SF的细胞干重可达 6石…，表达量为38二％。 其次，在SL发酵罐中，从pH值、溶氧、诱导时机等方面研究了重组大肠杆菌DH5a／pBV220分批补料培养的工艺条件，确定出稳定的发酵工艺参数。在SL发酵罐中用流加方式培养重组大肠杆菌时，细胞干重可达 12卫gg／L，rhG（SF的表达量为41．9％。4．rhG（SF’的分离纯化与同时复性 在高效疏水色谱（HPHIC）条件下优化分离纯化巾G－CSF的洗脱梯度和流动相流速，实现了复性与同时纯化。经过1次色谱纯化后，rhG－CSF的纯度可达97．8％，rhG．CSF的质量口收率达到24．0％。

全文目录


第一章 文献综述  11-22
  1．1 引言  11-12
  1．2 粒细胞集落刺激因子（G-CSF）概述  12-14
    1．2．1 G-CSF的生物学功能  12-13
    1．2．2 G-CSF发酵生产研究概况  13-14
  1．3 基因工程菌发酵工艺的优化  14-15
    1．3．1 培养基的影响  14
    1．3．2 培养条件的影响  14-15
      1．3．2．1 温度  14-15
      1．3．2．2 pH  15
      1．3．2．3 溶氧（DO）  15
      1．3．2．4 代谢副产物的抑制作用  15
      1．3．2．5 比生长速率和比产率  15
  1．4 基因工程菌的高密度培养  15-17
    1．4．1 重组大肠杆菌高密度培养概述  15-16
    1．4．2 高密度发酵补料调控  16-17
  1．5 基因工程药用蛋白的分离、纯化与复性  17-20
    1．5．1 重组蛋白的复性  18
    1．5．2 G-CSF的分离、纯化与复性  18-20
  参考文献  20-22
第二章 实验部分  22-32
  2．1 仪器与试剂  22-23
    2．1．1 rhG-CSF发酵所需仪器与试剂  22-23
      2．1．1．1 仪器  22
      2．1．1．2 试剂  22-23
    2．1．2 rhG-CSF分离纯化所需仪器与试剂  23
      2．1．2．1 仪器  23
      2．1．2．2 试剂  23
  2．2 实验方法  23-26
    2．2．1 菌种  23
    2．2．2 培养基的配制  23-24
      2．2．2．1 液体培养基的配制  24
      2．2．2．2 LB固体培养基的配制  24
      2．2．2．3 微量元素的配制  24
    2．2．3 培养方法  24-26
      2．2．3．1 菌种复苏  24
      2．2．3．2 菌种筛选  24-25
      2．2．3．3 5L发酵罐间歇培养  25
      2．2．3．4 5L发酵罐分批流加培养  25
      2．2．3．5 感受态细胞的制备  25-26
      2．2．3．6 大肠杆菌的转化  26
  2．3 结果分析  26-31
    2．3．1 菌体浓度  26
    2．3．2 细胞干重的测定  26
    2．3．3 rhG-CSF表达量  26-27
    2．3．4 SDS-PAGE  27-29
    2．3．5 PH  29
    2．3．6 Bradford比色法测定蛋白质含量  29-31
  参考文献  31-32
第三章 重组大肠杆菌DH5a／pBV220发酵培养基的优化研究  32-44
  3．1 前言  32-33
  3．2 不同培养基种类对工程菌生长和表达的影响  33
  3．3 M9培养基的优化  33-41
    3．3．1 碳源种类的选择  33-35
    3．3．2 氮源种类的选择  35-37
    3．3．3 优化培养基配方  37-41
      3．3．3．1 培养基中碳源和氮源配比的优化  37-40
      3．3．3．2 无机盐配方的优化  40-41
  3．4 优化培养基中工程菌DH5α／pBV220的培养  41-42
  3．5 小结  42-43
  参考文献  43-44
第四章 重组大肠杆菌DH5α／pBV220摇瓶发酵工艺的研究  44-55
  4．1 前言  44
  4．2 培养温度对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响  44-45
  4．3 pH值对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响  45-46
  4．4 摇瓶溶氧对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响  46-48
    4．4．1 装液量对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响  46-47
    4．4．2 摇床转速对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响  47-48
  4．5 诱导时机对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响  48-50
  4．6 诱导表达时间对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响  50-51
  4．7 种子菌龄对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响  51-52
  4．8 优化条件下工程菌的培养  52
  4．9 小结  52-54
  参考文献  54-55
第五章 重组大肠杆菌DH5α／pBV220在5L发酵罐上的培养  55-68
  5．1 前言  55
  5．2 5L发酵罐分批培养  55-61
    5．2．1 溶氧对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响  55-57
    5．2．2 微量元素和维生素对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响  57-58
    5．2．3 接种量对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响  58-59
    5．2．4 工程菌在M9Ⅳ培养基中分批培养的生长曲线及诱导时机  59-60
    5．2．5 CT-5发酵罐中优化条件下重组大肠杆菌的分批培养  60-61
  5．3 5L发酵罐补料分批培养  61-66
    5．3．1 分批流加培养方案  61
    5．3．2 工程菌DH5α／pBV220的生长曲线  61-62
    5．3．3 pH值对工程菌的生长和rhG-CSF表达的影响  62-63
    5．3．4 流加培养过程中溶氧对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响  63-65
      5．3．4．1 不控制溶氧的流加培养  63-64
      5．3．4．2 控制溶氧的流加培养  64-65
    5．3．5 重组大肠杆菌在优化条件下的流加培养  65-66
  5．4 小结  66-67
  参考文献  67-68
第六章 rhG-CSF的分离纯化  68-77
  6．1 前言  68
  6．2 实验方法  68-69
    6．2．1 菌体的收集和洗涤  68
    6．2．2 包含体的纯化  68
    6．2．3 包含体的溶液  68-69
  6．3 高效疏水色谱对rhG-CSF的复性与同时纯化  69-75
    6．3．1 洗脱梯度对rhG-CSF的复性与同时纯化的影响  69-70
    6．3．2 流动相流速对rhG-CSF的复性与同时纯化的影响  70-71
    6．3．3 不同洗脱条件下进样方式对rhG-CSF的复性与同时纯化的影响  71-72
    6．3．4 pH对rhG-CSF的复性与同时纯化的影响  72-73
    6．3．5 rhG-CSF的纯度和质量回收率  73-75
  6．4 关于蛋白质质量回收率问题的讨论  75
  6．5 小结  75-76
  参考文献  76-77
致谢  77

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 一般性问题
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