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CGA-N46基因在枯草杆菌中的多顺反子表达及表达条件优化

作　者: 薛雯雯
导　师: 李瑞芳
学　校: 河南工业大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 枯草杆菌表达系统多顺反子基因工程 CGA-N46 抗真菌活性发酵条件优化
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

由白假丝酵母等病原真菌引起的艾滋病等免疫机能受损病人死亡的增加、现有抗真菌药物对宿主细胞的潜在毒性及耐药病原真菌的增多,使得对高效低毒的新型抗真菌药物的研究具有重要意义。嗜铬粒蛋白A是多种生物活性多肽的前体,其N端衍生多肽CGA-N46是一种短且具较高抗白假丝酵母活性的肽段,有望研发成为新型小分子肽类抗真菌药物。本研究以“SD序列+起始密码子+信号肽序列+ CGA-N46基因编码序列+终止密码子”为外源片段,利用一对同尾酶NheⅠ和SpeⅠ,以pMD18-T为克隆载体,构建了单、双和三拷贝CGA-N46基因的重组T载体pT-N46-KpnⅠ、pT-2N46和pT-3N46;将不同拷贝数CGA-N46基因亚克隆至携带SacB启动子和淀粉酶终止子序列的表达载体pSBPTQ上,构建了单、双和三顺反子重组表达载体p-N46、p-2N46和p-3N46;利用感受态转化法转化蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌DB1342,获得枯草芽孢杆菌工程菌DB1342(p-N46)、DB1342(p-2N46)和DB1342(p-3N46) ,并进行表达研究。SDS-PAGE电泳结果可知,在蔗糖诱导下,单、双顺反子表达系统表达量较低,几乎看不到目的蛋白表达,而三顺反子表达系统目的蛋白表达量明显提高,并以可溶性单体被分泌到培养基中。为进一步提高三顺反子表达系统目的蛋白表达量,本研究对表达条件进行了优化。研究1%的可溶性淀粉、糊精、麦芽糖、乳糖、甘油、葡萄糖等碳源对CGA-N46表达量的影响,发现1%糊精使CGA-N46表达量明显提高;研究2%的蛋白胨、酪蛋白水解物(casein)、(NH4)2SO4、2%蛋白胨+2%casein、2%casein+2%(NH4)2SO4、2%蛋白胨+2%(NH4)2SO4、2%蛋白胨+2%casein+2%(NH4)2SO4等氮源对CGA-N46表达量的影响,发现氮源为2%蛋白胨+2%casein时,CGA-N46表达量最高;研究培养基初始pH值和诱导时间对CGA-N46表达量的影响,发现初始pH为7.5、蔗糖诱导56h,目的蛋白表达量最高。采用保湿培养法和琼脂扩散法研究CGA-N46对白假丝酵母生长的抑制作用,结果表明,重组CGA-N46可明显抑制白假丝酵母的生长,抑菌圈直径达到20mm。本论文研究结果为将CGA-N46开发成抗真菌药物奠定了基础。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
第一章前言  9-19
  1.1 真菌病概况  9
  1.2 抗真菌药物研究现状  9-11
  1.3 抗菌肽简介  11
  1.4 嗜铬粒蛋白及其衍生多肽研究进展  11-13
  1.5 枯草杆菌表达系统的特点  13-14
  1.6 串联技术在基因工程表达小分子肽中的应用  14-16
  1.7 发酵条件优化在基因表达中的应用  16-17
  1.8 本论文研究的目的和主要内容  17-19
    1.8.1 本论文研究目的  17
    1.8.2 本论文主要实验内容  17-19
第二章实验材料和方法  19-31
  2.1 实验材料  19-24
    2.1.1 菌株与质粒  19
    2.1.2 工具酶和试剂盒  19
    2.1.3 主要试剂  19-20
    2.1.4 主要溶液  20-21
    2.1.5 培养基  21-24
    2.1.6 主要仪器  24
  2.2 方法  24-31
    2.2.1 大肠杆菌质粒的小量提取  24-25
    2.2.2 大肠杆菌质粒的大量提取  25
    2.2.3 PCR 反应  25-26
    2.2.4 DNA 酶切反应  26
    2.2.5 酶切片段的回收  26-27
    2.2.6 连接反应  27
    2.2.7 大肠杆菌转化  27
    2.2.8 枯草杆菌转化  27-28
    2.2.9 重组质粒的酶切鉴定  28
    2.2.10 基因序列分析  28
    2.2.11 CGA-N46 基因在Bacillus subtilis D81342 中的诱导表达  28
    2.2.12 分离小分子蛋白的SDS-PAGE  28-29
    2.2.13 真菌孢子悬浮液的制备  29-30
    2.2.14 表达产物的抗真菌活性分析  30-31
第三章结果与分析  31-60
  3.1 基因的克隆  31-57
    3.1.1 PCR 引物的合成  31
    3.1.2 PCR 扩增  31-33
    3.1.3 PCR 产物的TA 克隆  33-38
    3.1.4 双拷贝CGA-N46 基因重组T 载体的构建  38-39
    3.1.5 三拷贝CGA-N46 基因重组T 载体的构建  39-41
    3.1.6 单顺反子CGA-N46 基因重组表达载体的构建  41-43
    3.1.7 双顺反子CGA-N46 基因重组表达载体的构建  43-45
    3.1.8 三顺反子CGA-N46 基因重组表达载体的构建  45-47
    3.1.9 单、双、三顺反子CGA-N46 基因在枯草杆菌D81342 中的表达  47-48
    3.1.10 枯草杆菌工程菌表达条件优化  48-53
    3.1.11 发酵条件优化前后三顺反子CGA-N46 基因在枯草杆菌D81342 中表达量的比较  53-54
    3.1.12 CGA-N46 的抗真菌活性分析  54-57
  3.2 讨论  57-60
    3.2.1 多顺反子表达系统的讨论  57-58
    3.2.2 表达条件优化的讨论  58-60
第四章结论  60-61
参考文献  61-66
致谢  66-67
附录  67-68
个人简历  68

CGA-N46基因在枯草杆菌中的多顺反子表达及表达条件优化

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