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SIRNA抑制MRP基因表达逆转肿瘤多药耐药的体内外研究

作　者: 武卓
导　师: 肖红
学　校: 南京医科大学
专　业: 药理学
关键词: siRNA MRP 多药耐药移植瘤
分类号: R73-3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景与目的：恶性肿瘤产生的多药耐药(multidrug-resistance, MDR)已成为当前影响肿瘤化学治疗疗效的主要障碍。MDR产生机制复杂，其中由多药耐药相关蛋白（multidrug resistance associated protein 1，MRP1）基因编码的MRP1的过度表达是产生MDR的原因之一。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是近年来兴起的一种基因技术，指在广泛的生物范围内都存在的由双链RNA (doublestranded RNA, dsRNA)介导的同源基因表达受抑制的现象，可使内源性mRNA发生特异性降解，从而代替传统反义核酸技术进行转录后基因沉默。本研究探讨体外和体内转染靶分子为MRP1的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）后，肿瘤细胞及裸鼠移植瘤对化疗药物敏感性的影响，从而为克服化疗过程中的肿瘤多药耐药提供一种新的解决手段。方法：利用Dharmacon公司的RNA在线工具，设计了4对针对MRP1基因不同区域的siRNA序列。体外实验中，将4对siRNA序列分别转染至NCI-H460、U251、MCF-7细胞株，转染后24及48小时，采用逆转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）检测细胞中MRP1 mRNA的表达情况。根据mRNA的被抑制的程度，选择具有较好的抑制效果的2个干扰序列转染NCI-H460、U251、MCF-7细胞株，观察其对肿瘤细胞多药耐药的逆转情况，采用Western Blot技术检测转染72小时后蛋白的表达情况，采用MTT法检测转染后肿瘤细胞对广谱抗肿瘤药表柔比星，长春新碱，紫杉醇敏感性的变化。经上述实验筛选，确认出在体外具有较好的辅助肿瘤化疗效果的siRNA序列，进一步探讨其在体内逆转肿瘤多药耐药的效果。本研究构建了裸鼠人肺癌移植瘤模型，联合运用活体电穿孔和瘤内注射转染技术，将MRP1 siRNA转染入移植瘤内，采用RT-PCR和免疫组化方法检测肿瘤组织中MRP1 mRNA和蛋白的表达情况，为了研究siRNA和化疗药物联合使用对肿瘤的治疗情况，于给药后绘制肿瘤的生长曲线，并于实验结束时，提取移植瘤，称重，计算抑瘤率。结果：siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4四个序列转染三种细胞后的RT-PCR实验结果说明siRNA2和siRNA4对MRPmRNA有较强的抑制作用；三种细胞内转染siRNA2和siRNA4后的RT-PCR和Western blot结果分别显示MRP1 mRNA和蛋白的表达较未转染组均明显下降；药敏实验结果显示转染后，肿瘤细胞对表柔比星和长春新碱的敏感性增加而对紫杉醇的敏感性没有明显改变；体外实验证明siRNA2序列最有效。裸鼠人移植瘤内转染siRNA2后，RT-PCR和免疫组化结果显示siRNA2能有效抑制mRNA和蛋白的表达。同时，siRNA2和抗肿瘤药联合使用治疗移植瘤可使肿瘤的生长显著减慢，表柔比星的抑瘤率明显提高。结论：肿瘤细胞和裸鼠人移植瘤内转染特异性的MRP1 siRNA后能明显降低其mRNA和蛋白的表达，从而使肿瘤细胞和移植瘤对抗肿瘤药物的敏感性增加，因此RNAi联合化疗药物同时使用可能成为肿瘤治疗的一种新策略。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-8
前言  8-13
第一章 siRNA 体外逆转肿瘤细胞的多药耐药性  13-34
  摘要  13-16
  材料和方法  16-23
  结果  23-32
  讨论  32-34
第二章 siRNA 体内逆转裸鼠人移植瘤的多药耐药性  34-50
  摘要  34-36
  材料与方法  36-41
  结果  41-47
  讨论  47-50
全文结论  50-51
参考文献  51-58
综述  58-77
  参考文献  72-77
附录  77-78
攻读学位期间发表文章情况  78-79
致谢  79

SIRNA抑制MRP基因表达逆转肿瘤多药耐药的体内外研究

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