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抚顺东部山区放线菌的筛选及其生物活性物质研究

作　者: 谢银堂
导　师: 杨翔华
学　校: 辽宁石油化工大学
专　业: 生物化工
关键词: 土壤放线菌筛选链霉菌发酵培养生物活性物质
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

2008年7月从抚顺龙岗山、黄旗乡东山、木奇镇猴石森林公园、湾甸子镇滚马岭等地区采集土样40份。用稀释平板法分离放线菌,经过拮抗性的初筛和复筛,选择拮抗效果最好的菌株作为目的菌株。对目的菌株进行鉴定试验,包括:形态学特征、培养特征、细胞壁化学成分分析、生理生化特征、16S rDNA分子学试验。对其发酵培养基和发酵条件进行优化,主要考察因素包括:碳源、氮源、温度、接种菌株的种龄、初始pH、接种量、摇床转速和发酵时间。选择7种病原真菌和8种病原细菌对目的菌株进行抗菌谱的测定。试验成功分离到319株放线菌,经鉴定归类到7个属,分别是Streptomyces、Nocardia、Streptosporangium、Actinoplanes、Saccharopolyspora、Ampullariella和Micropolyspora。Streptomyces（链霉菌属）最多,其次是Nocardia （诺卡氏菌属）和Streptosporangium（孢囊链霉菌属）,其他菌属较少。链霉菌分离到8个类群:优势类群为灰褐类群,分离频率达到91.35%;其次是灰红紫类群,分离频率为82.15%,金色类群很少,仅在荒草地中分离到。抚顺东部山区土壤放线菌数量受采样点土壤环境的影响变化较大。土壤放线菌数量随有机质含量的增加而增加,pH值接近中性的土壤中放线菌含量最高。菌株XY-35经形态学特征、培养特征、生理生化特性和16S rDNA综合特征进行鉴定,初步鉴定为链霉菌属灰红紫类群。通过单因素试验和正交试验研究得出菌株XY-35的最佳发酵条件为:酵母粉2%、葡萄糖2%、NaCl 0.8%、CaCO₃ 0.2%、（NH ）₂SO₄ 0.32% ,初始pH值7.5、发酵温度为28℃、发酵时间为6 d、摇床转速为160 r/min。菌株XY-35对7种病原真菌及8种病原细菌均有具有抑制作用,是一株广谱拮抗菌。菌株XY-35的代谢产物可以作为新的杀菌药物进行开发和研究。这种代谢产物可以使病原真菌的细胞质凝集,使菌丝纠结、膨大,甚至出现扭曲现象。产生这种现象的原因还不清楚,其具体的杀菌机理需要继续实验,进行深入研究。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
1 文献综述  12-24
  1.1 放线菌简介  12-14
  1.2 放线菌的分类方法  14-18
    1.2.1 传统分类法  14
    1.2.2 数值分类法  14-15
    1.2.3 化学分类法  15
    1.2.4 基因型分类法  15-17
    1.2.5 多相分类方法  17-18
  1.3 放线菌多样性  18-19
    1.3.1 放线菌物种多样性  18
    1.3.2 放线菌代谢产物多样性  18
    1.3.3 放线菌生态多样性  18-19
  1.4 放线菌的生态分布  19-20
  1.5 放线菌的应用研究  20-22
    1.5.1 放线菌在抗生素方面的应用  20-21
    1.5.2 放线菌在生物农药方面的应用  21-22
    1.5.3 放线菌在其它方面的应用  22
  1.6 选题的目的及意义  22-24
2 研究方案  24-37
  2.1 主要研究内容与目的  24
    2.1.1 主要研究内容  24
    2.1.2 主要研究目的  24
  2.2 实验材料  24-28
    2.2.1 样品采集  24-25
    2.2.2 主要试剂  25
    2.2.3 主要仪器  25
    2.2.4 供试菌  25-26
    2.2.5 培养基  26-28
  2.3 实验方法  28-37
    2.3.1 分析土样基本性质  28
    2.3.2 土壤放线菌的分离和纯化  28-29
    2.3.3 拮抗放线菌的初筛  29-30
    2.3.4 拮抗放线菌的复筛  30
      （1）纸碟法  30
      （2）生长速率法测定拮抗性  30
    2.3.5 拮抗放线菌的初步分类与鉴定  30-31
    2.3.6 拮抗放线菌的生理生化测定  31-33
    2.3.7 优良菌株XY-35 的鉴定  33-34
      （1）形态学观察  33
      （2）培养特征  33-34
      （3）细胞壁化学成分分析  34
      （4）生理生化特征  34
      （5）拮抗菌分子生物学鉴定  34
    2.3.8 拮抗菌株XY-35 发酵条件的优化  34-36
      （1）基础发酵培养基的筛选  34-35
      （2）碳源、氮源对菌株XY-35 发酵滤液抑菌作用的影响  35
      （3）温度对发酵滤液抑菌作用的影响  35
      （4）接种菌株的种龄对发酵滤液抑菌作用的影响  35
      （5）初始pH 值对发酵滤液抑菌作用的影响  35
      （6）接种量对发酵滤液抑菌作用的影响  35-36
      （7）摇床转速对发酵滤液抑菌作用的影响  36
    2.2.9 菌株XY-35 发酵条件的正交试验  36
    2.3.10 菌株XY-35 抗菌谱的测定  36-37
3 结果与分析  37-49
  3.1 抚顺东部山区土壤放线菌数量、种类及其多样性研究  37-39
    3.1.1 土壤样品分析  37
    3.1.2 土壤样品放线菌数量分布  37-38
    3.1.3 土壤放线菌的种类及其多样性研究  38-39
  3.2 拮抗放线菌的筛选  39-40
    3.2.1 拮抗放线菌的初筛结果  39
    3.2.2 拮抗放线菌的复筛结果  39-40
  3.3 菌株XY-35 的鉴定  40-42
    3.3.1 形态特征  40
    3.3.2 培养特征观察  40
    3.3.3 生理生化特性  40-42
    3.3.4 细胞壁化学成分  42
    3.3.5 基因序列分析  42
  3.4 菌株XY-35 发酵条件的研究及优化  42-46
    3.4.1 基础发酵培养基的筛选  42-43
    3.4.2 碳、氮源对菌株XY-35 发酵液抑菌活性影响  43
    3.4.3 发酵温度对发酵滤液抑菌作用的影响  43
    3.4.4 接种菌株种龄对发酵滤液抑菌作用的影响  43-44
    3.4.5 初始pH 值对发酵滤液抑菌作用的影响  44-45
    3.4.6 接种量对发酵滤液抑菌作用的影响  45-46
    3.4.7 摇床转速对发酵滤液抑菌作用的影响  46
  3.5 菌株XY-35 发酵条件优化的正交试验  46-47
  3.6 菌株XY-35 抗菌谱的测定  47-49
4 结论  49-51
  4.1 抚顺东部山区土壤放线菌的数量  49
  4.2 抚顺东部山区土壤放线菌的种类及其多样性  49
  4.3 抚顺东部山区土壤拮抗性放线菌的生态分布  49-50
  4.4 菌株XY-35 的鉴定  50
  4.5 菌株XY-35 的最佳发酵条件  50
  4.6 菌株XY-35 抗菌谱测定及其拮抗机制的研究  50-51
符号说明  51-52
参考文献  52-57
致谢  57-58
攻读学位期间发表的学术论文目录  58

抚顺东部山区放线菌的筛选及其生物活性物质研究

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