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棉花GhNCED1和GhNCED2基因的克隆及其在干旱条件下的表达分析

作　者: 刘江娜
导　师: 魏亦农
学　校: 石河子大学
专　业: 作物遗传育种学
关键词: 棉花干旱胁迫脱落酸 9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED) 半定量RT-PCR
分类号: S562
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：脱落酸(abscisic acid, ABA)在植物抗逆境胁迫反应中起着广泛而重要的作用,干旱、高盐和低温胁迫均能引起植物内源ABA水平的提高。因此,近些年来对于ABA在植物适应逆境胁迫中的作用的研究备受关注。而研究ABA合成过程中的关键酶,通过基因工程来调控植物体内的内源ABA的生物合成,已经成为提高植物抗逆性的一个重要途径。生物化学和遗传学的证据表明由9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxy carotenoid dioxygenase, NCED)所催化的氧化裂解反应是高等植物ABA合成途径中的关键步骤。前人的大量研究表明NCED基因受逆境胁迫的诱导,其表达产物能够调控逆境条件下ABA的生物合成。到目前为止尚未见到棉花中NCED基因的克隆和研究的相关报道,因此本研究期望通过了解棉花9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)基因在干旱胁迫下的生物学功能从而为解决棉花逆境胁迫提供理论依据。方法：本研究以棉花(晋13)幼苗叶片为材料,根据ncbi.上已经登录的NCED基因的同源序列设计简并引物,用RT-PCR结合RACE以及巢式PCR的方法,分别克隆到了两个编码NCEDs的基因GhNCED1和GhNCED2全长,并利用半定量RT-PCR分析了两个基因在干旱胁迫下的空间表达水平,同时利用HPLC的方法测定干旱胁迫下棉花叶片中内源ABA的变化。结果：1根据ncbi上已经登录的NCED基因的同源序列设计简并引物,用RT-PCR结合RACE以及巢式PCR的方法,从干旱胁迫的棉花叶片中分别克隆了两个与抗旱相关的GhNCEDl和GhNCED2基因的全长。(GhNCEDl的cDNA全长由2125bp组成,其中5’非编码区15bp,3’非编码区283bp,开放阅读框架为1827bp,编码609个氨基酸,分子量为67.89KDa,等电点为5.94; GhNCED1基因cDNA序列全长为2134bp,其中包括5’端13bp和3’端327bp的非编码区和1794bp的开放阅读框,最后以polyA结尾,开放阅读框编码598个氨基酸,分子量为66.72KDa,等电点为6.85。分别对这两个基因的蛋白质结构进行预测分析发现,GhNCED2与已经报道的NCED家族基因的第一类一样,N-末端有一个典型的由30个氨基酸组成的叶绿体转运肽;而在GhNCED1上则没有发现。2.利用半定量RT-PCR技术,对干旱胁迫下棉花GhNCED1和GhNCED2基因的表达进行分析。结果表明,GhNCED1基因在未胁迫材料的根、茎、叶中均有表达,且在干旱胁迫下其表达量并未发生明显变化；GhNCED2基因在未胁迫的条件下的茎和叶中少量表达,在根中并不表达,但在干旱胁迫下的茎和叶中高度表达,而根中仍只有少量表达。3.利用HLPC方法测定干旱胁迫下棉花幼苗叶片中的ABA含量的变化,结果发现干旱胁迫下其含量的变化呈现出先上升后下降趋势,这与GhNCED2表达量的变化趋势基本一致,只是ABA的积累要稍稍落后于GhNCED2的表达。结论：本研究结合RT-PCR, RACE技术,以及巢式PCR的方法,从棉花中克隆了2个棉花GhNCED基因分别命名为GhNCED1和GhNCED2,并对这两个基因在干旱胁迫下的表达与ABA积累的关系作了初步分析,初步推测GhNCED1并不参与棉花体内ABA的合成,而干旱胁迫下GhNCED2的表达却与ABA的积累呈线性关系,因而推测GhNCED2可能是ABA生物合成过程中的关键酶。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
目录  9-11
缩略表  11-12
引言  12-13
第一章文章综述  13-27
  1.1 ABA的发现,分布与高等植物体内ABA的合成  13-19
    1.1.1 ABA的合成部位  13-14
    1.1.2 ABA生物合成缺陷型突变体  14
    1.1.3 ABA生物合成途径  14-15
    1.1.4 ABA生物合成酶及其限制性调控  15-19
    1.1.5 ABA的分解代谢  19
  1.2 ABA的生理作用  19-20
    1.2.1 促进气孔关闭  19
    1.2.2 促进休眠  19-20
    1.2.3 提高抗逆性  20
  1.3 ABA在植物干旱胁迫反应中的作用  20-23
    1.3.1 ABA调节气孔关闭,降低蒸腾失水,提高植物抗旱能力  20-21
    1.3.2 ABA诱导相关基因产物产生,保护细胞结构,调节植物生理、代谢变化  21-23
  1.4 ABA合成的信号转导途径  23-24
    1.4.1 ABA结合位点与受体  23
    1.4.2 信号转换  23-24
  1.5 ABA的抗胁迫机制  24-26
    1.5.1 ABA参与了气孔的调控  25
    1.5.2 基因和蛋白表达调控  25-26
  1.6 选题背景、目的和意义  26-27
第二章材料与方法  27-40
  2.1 材料与方法  27-28
    2.1.1 材料  27
    2.1.2 菌株和载体  27
    2.1.3 试剂  27-28
    2.1.4 培养基  28
    2.1.5 主要仪器  28
  2.2 所用引物  28-29
  2.3 试验方法  29-40
    2.3.1 材料培养  29-30
    2.3.2 RNA的提取及纯化  30-31
    2.3.3 棉花cDNA第一条连的合成  31
    2.3.4 棉花GhNCED1和GhNCED2基因主体片段的克隆  31-34
    2.3.5 棉花GhNCED1和GhNCED2基因的cDNA5’和3’末端快速扩增—RACE  34-36
    2.3.6 棉花GhNCED1基因全长的获得和GhNCED2基因全长的获得  36
    2.3.7 生物信息学分析  36
    2.3.8 棉花GhNCED1和GhNCED2基因结构的初步分析  36-37
    2.3.9 半定量RT-PCR方法检测棉花GhNCED1和GhNCED2基因在干旱胁迫下的表达  37-38
    2.3.10 半定量RT-PCR法检测GhNCED1和GhNCED2基因在棉花不同组织中的表达  38
    2.3.11 干旱胁迫下棉花幼苗叶片中ABA含量的测定  38-40
第三章结果与分析  40-53
  3.1 RNA提取  40
  3.2 棉花GhNCED1和GhNCED2基因主体片段的扩增结果  40-41
  3.3 棉花GhNCED1和GhNCED2基因3’端的克隆结果  41-42
  3.4 棉花GhNCED1和GhNCED2基因5’端的克隆结果  42
  3.5 棉花GhNCED1和GhNCED2基因全长的获得  42-45
  3.6 棉花GhNCED1和GhNCED2基因的氨基酸序列分析  45-48
  3.7 GhNCED1和GhNCED2基因完整编码框及相应基因组序列的克隆  48-49
  3.8 干旱胁迫对棉花GhNCED1和GhNCED2基因表达的影响  49-50
  3.9 棉花GhNCED1和GhNCED2在棉花不同组织中的特异性表达  50
  3.10 棉花幼苗叶片ABA的提取及其在干旱胁迫下含量的变化  50-53
    3.10.1 分析条件选择  50-51
    3.10.2 脱落酸的分离与测定  51-52
    3.10.3 回收试验  52-53
第四章讨论  53-56
  4.1 总RNA的提取  53
  4.2 棉花GhNCED1和GhNCED2基因的克隆  53-54
  4.3 利用HPLC法检测棉花幼苗叶片中的ABA  54
  4.4 干旱胁迫下GhNCED1l和GhNCED2的表达及其和ABA积累的关系  54-56
第五章结论  56-58
参考文献  58-63
作者简介  63-64
致谢  64-65
石河子大学硕士研究生学位论文  65

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