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油茶根腐病原菌及其PCR快速检测技术研究

作　者: 郝芳
导　师: 周国英
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 微生物学
关键词: 油茶根腐病 病原菌 生物学特性 巢式PCR
分类号: S763.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


油茶根腐病Camellia oleifera root rot是普遍危害油茶树的一种根部病害。受害油茶根部腐烂,导致植株不能正常吸收养分和水分而干枯死亡,给油茶生产带来了严重的威胁,根腐病已经成为我国油茶可持续发展的限制性因子之一。本实验以油茶根腐病为研究对象,进行病原菌的分离鉴定、生物学特性、巢式PCR快速检测等研究。(1)油茶根腐病病原菌的分离与鉴定。采集了14份发病的油茶根腐病的样本,用组织分离法进行分离,结果分离到同一种病原菌。将分离得到的菌株采用有伤接种和无伤接种两种方法,结果表明：采用的有伤将接种和无伤接种结果均显示此病原菌具有较强的致病性,接种后植株发病与田间自然发病症状相同,并且可再次分离到与接种体相同的病原菌。通过对其形态特征的观察及该菌的核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区ITS区并测定其序列,并与Genbank中经Blast搜索获得的部分菌株构建分子系统发育树。基于形态特征和分子系统发育树,最后确定引起油茶根腐病的病原菌为镰刀属李瑟组层生镰刀菌Fusarium proliferatum。(2)油茶根腐病原菌层生镰刀菌菌株G9生物学特性的研究。研究结果表明该病原菌在人工培养条件,生长的最适温度为25℃；最适宜生长的pH值为5-7；光照对该病原菌的生长速率无明显影响。分生孢子在相对湿度为90%以下不能生长,在相对湿度为100%(水滴)中才能很好的萌发；病菌生长的致死温度为60℃10 min；病菌生长较好的碳源为可溶性淀粉,氮源为氯化铵。(3)油茶根腐病菌层生镰刀菌G9的巢式PCR快速检测体系建立。扩增层生镰刀菌核糖体DNA ITS区并测定其序列,比较该序列与GenBank中近似种的ITS序列差异,设计了特异性引物G1和G2,利用该对引物与ITS1和ITS4进行巢式PCR扩增检测层生镰刀菌。巢式PCR对层生镰刀菌的检测灵敏度可达100 ag基因组DNA,比常规扩增方法提高了10000倍。利用设计的G1/G2特异性引物与ITS区通用引物进行巢式PCR扩增,可灵敏的扩增出油茶根腐病菌层生镰刀菌DNA。本研究分离鉴定了引起油茶根腐病的病原菌层生镰刀菌,为正确用药、合理防治油茶根腐病提供了理论依据；对该菌的生物学特性进行研究,明确病原菌的生活习性及其对环境条件的要求,有利于制定出有效防治油茶根腐病的方案。同时本研究建立的巢式PCR检测方法,为油茶根腐病的早期诊断与防治、病害的预测预报提供了一条行之有效的技术手段。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
1 绪论  11-29
  1.1 油茶根腐病发生与危害  11-13
    1.1.1 危害症状  11-12
    1.1.2 发病规律  12-13
  1.2 根腐病病原的菌系与分类研究  13-15
    1.2.1 疫霉菌  13-14
    1.2.2 镰刀菌  14-15
    1.2.3 丝核菌  15
  1.3 真菌种类鉴定方法  15-23
    1.3.1 形态学方法  17-18
    1.3.2. 生理生化方法  18-19
    1.3.3 分子生物学方法  19-22
    1.3.4 ITS序列在真菌鉴定中的应用  22-23
  1.4 植物病原菌检测方法  23-28
    1.4.1 植物病原菌的田间传统诊断方法  23
    1.4.2 免疫学检测技术  23-24
    1.4.3 分子生物学检测方法  24-26
    1.4.4 巢式PCR技术(nested-PCR)检测技术的应用  26-28
  1.5 本论文研究目的意义及主要研究内容  28-29
2 油茶根腐病病原菌的分离与鉴定  29-41
  2.1 材料与方法  29-34
    2.1.1 供试材料  29
    2.1.2 培养基  29
    2.1.3 主要药剂  29-30
    2.1.4 病原菌分离和保存  30
    2.1.5 病原菌的形态学观察  30
    2.1.6 病原菌的致病性试验  30-31
    2.1.7 油茶根腐病病原菌ITS序列测定  31-34
  2.2 主要仪器设备  34-35
  2.3 结果与分析  35-39
    2.3.1 油茶根腐病症状  35
    2.3.2 病原菌培养性状  35-36
    2.3.3 致病性检验结果  36
    2.3.4 油茶根腐病原菌株rDNA ITS测序  36-37
    2.3.5 油茶根腐病分离菌株ITS序列对比  37-38
    2.3.6 油茶根腐病分离菌株系统发育树的构建分析  38-39
  2.4. 小结  39-41
3 油茶根腐病原菌生物学特性研究  41-47
  3.1 材料与方法  41-42
    3.1.1 供试菌株  41
    3.1.2 不同温度对该病原菌菌丝生长的研究  41
    3.1.3 不同pH对该病原菌菌丝生长的研究  41
    3.1.4 不同光照对该病原菌菌丝生长的研究  41
    3.1.5 不同湿度对该病原菌孢子生长的研究  41-42
    3.1.6 该病原菌孢子的致死温度的研究  42
    3.1.7 不同碳氮源对病菌菌丝生长的研究  42
  3.2 结果与分析  42-46
    3.2.1 温度对病原菌菌丝生长的影响  42-43
    3.2.2 pH值对病原菌菌落生长的影响  43-44
    3.2.3 光照对该病原菌生长的影响  44
    3.2.4 湿度对该病原菌孢子生长的影响  44-45
    3.2.5 病原菌孢子的致死温度  45
    3.2.6 碳氮源对菌丝生长的影响  45-46
  3.3 小结  46-47
4 油茶根腐病原菌nested PCR快速检测方法的建立  47-52
  4.1 材料与主要仪器  47
    4.1.1 供试菌株  47
    4.1.2 主要仪器和设备  47
    4.1.3 主要试剂和溶液  47
  4.2 试验方法  47-49
    4.2.1 引物的设计  47-48
    4.2.2 供试菌的处理  48
    4.2.3 油茶发病组织DNA的提取  48
    4.2.4 标准PCR反应体系和条件的建立  48-49
    4.2.5 巢式PCR扩增  49
    4.2.6 引物专化性和灵敏度的验证  49
  4.3 结果与分析  49-51
    4.3.1 引物G1和G2特异性验证  49
    4.3.2 nested-PCR灵敏度扩增结果  49-50
    4.3.3 油茶发病组织的病原物检测  50-51
  4.4 小结  51-52
5 结论与讨论  52-54
  5.1 油茶根腐病原菌的分离与鉴定  52
  5.2 油茶根腐病原菌生物学特性研究  52
  5.3 巢式PCR快速检测技术  52-54
参考文献  54-61
攻读学位期间主要的学术成果  61-62
致谢  62

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林保护学 > 森林病虫害及其防治 > 各种树的病虫害及其防治
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