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PMA-qPCR选择性检测水中活性菌方法的研究与应用

作　者: 仝铁铮
导　师: 何苗
学　校: 清华大学
专　业: 环境科学与工程
关键词: PMA-qPCR 活性菌病原菌检测污水处理消毒特性
分类号: R123.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

快速、准确检测水中活性病原菌对预防水传播性疾病暴发和保障水质安全具有重要意义。本研究针对常规qPCR技术无法区分活性菌和非活性菌的不足,建立了一种将核酸染料PMA(propidium monoazide)与qPCR相结合的检测方法(PMA-qPCR),可以对细胞膜完整的活性病原菌进行选择性检测,研究中利用该方法分析了典型病原指示菌在污水处理过程中的去除特性,特别对常用消毒方式对大肠杆菌的消毒特性做了深入探讨。得到以下主要结论:(1)PMA染料能够在qPCR分析中有效去除来自于非活性菌的DNA,并且不会对活性菌DNA的检测结果产生明显影响,PMA-qPCR方法能够对样品中细胞膜完整的活性菌进行选择性检测,但该方法对不同类型活性菌的选择性检测效果有所差异。(2)PMA-qPCR方法适用于污水处理厂进水、二级出水、二沉池污泥等不同实际样品中活性菌的选择性检测,但初沉池污泥会明显抑制PMA-qPCR的选择性检测效果,该方法的实际应用具有局限性。(3)PMA-qPCR方法对污水处理过程中病原指示菌的检测结果与培养法的检测结果之间具有良好的线性相关性,且差异不显著,与常规qPCR相比,该方法的检测结果更接近于培养法,表明PMA-qPCR方法能够满足污水处理过程中活性病原菌的检测要求。(4)PMA-qPCR、常规qPCR和培养法的检测结果共同表明,一级处理工艺对大肠杆菌和粪肠球菌均没有明显的去除效果,二级处理工艺对这两种病原指示菌的去除率在1.5 log10左右。(5)PMA-qPCR方法能够表征氯和一氯胺两种消毒方式对大肠杆菌的灭活效果。该方法得到的氯和一氯胺对大肠杆菌的灭活曲线符合一级动力学方程,灭活速率常数分别为2.24 L/(mg·min)和0.0175 L/(mg·min),低于培养法得到的灭活速率常数,表明氯和一氯胺对病原菌细胞膜的破坏速率低于其对病原菌可培养性的破坏速率。但目前的研究表明PMA-qPCR尚无法准确评价紫外消毒对大肠杆菌的灭活效果。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-10
第1章绪论  10-31
  1.1 研究背景与意义  10-12
  1.2 水中病原菌检测技术的研究现状与分析  12-16
    1.2.1 培养法  12-13
    1.2.2 聚合酶链式反应技术  13-14
    1.2.3 基因芯片技术  14-16
    1.2.4 免疫检测技术  16
  1.3 细菌的活性及活性菌检测方法  16-29
    1.3.1 细菌活性的定义  17
    1.3.2 活性菌的选择性检测方法  17-26
    1.3.3 各种检测方法的比较  26-29
  1.4 研究目的与内容  29-31
    1.4.1 研究目的  29
    1.4.2 研究内容  29-30
    1.4.3 技术路线  30-31
第2章 PMA-qPCR 选择性检测活性菌方法建立与性能评估  31-49
  2.1 概述  31-33
  2.2 材料与方法  33-39
    2.2.1 试验材料  33-34
    2.2.2 PMA 反应过程  34
    2.2.3 简单样品中DNA 的提取  34-35
    2.2.4 环境样品中DNA 的提取  35-36
    2.2.5 qPCR 目的基因、引物与探针的选择  36-37
    2.2.6 qPCR 标准品的制备  37
    2.2.7 qPCR  37-38
    2.2.8 PMA-qPCR 方法对不同种类活性菌的选择性检测  38
    2.2.9 样品基质对PMA-qPCR 方法选择性检测效果的影响  38-39
    2.2.10 取样体积对PMA-qPCR 方法选择性检测效果的影响  39
  2.3 结果与讨论  39-47
    2.3.1 qPCR 的定量检测范围、标准曲线及特异性分析  39-43
    2.3.2 PMA-qPCR 检测方法对不同种类活性菌的选择性检测  43-44
    2.3.3 样品基质对PMA-qPCR 方法选择性检测效果的影响  44-46
    2.3.4 水样体积对PMA-qPCR 方法选择性检测效果的影响  46-47
  2.4 小结  47-49
第3章应用PMA-qPCR 方法检测污水处理中病原菌研究  49-65
  3.1 概述  49-50
  3.2 材料与方法  50-53
    3.2.1 试验材料  50
    3.2.2 水样及预处理方法  50-51
    3.2.3 样品的PMA-qPCR 和常规qPCR 检测  51-52
    3.2.4 大肠杆菌的培养法测定  52
    3.2.5 粪肠球菌的培养法测定  52
    3.2.6 污水处理过程各样品中PCR 抑制物的检验  52
    3.2.7 数据分析方法  52-53
  3.3 结果与讨论  53-63
    3.3.1 污水处理过程各样品中PCR 抑制物的检验  53
    3.3.2 污水处理过程中典型病原指示菌的浓度水平与去除特性  53-59
    3.3.3 不同检测方法检测结果的差异性与相关性分析  59-62
    3.3.4 不同病原指示菌检测结果的相关性分析  62-63
  3.4 小结  63-65
第4章基于PMA-qPCR 方法的病原指示菌消毒特性研究  65-76
  4.1 概述  65
  4.2 基于PMA-qPCR 方法的氯消毒对大肠杆菌的消毒特性  65-68
    4.2.1 试验材料  65-66
    4.2.2 试验方法  66
    4.2.3 结果与讨论  66-68
  4.3 基于PMA-qPCR 方法的一氯胺消毒对大肠杆菌的消毒特性  68-71
    4.3.1 试验材料  68-69
    4.3.2 试验方法  69
    4.3.3 结果与讨论  69-71
  4.4 基于PMA-qPCR 方法的紫外消毒对大肠杆菌的消毒特性  71-74
    4.4.1 试验材料  71
    4.4.2 试验方法  71-72
    4.4.3 结果与讨论  72-74
  4.5 小结  74-76
第5章结论和建议  76-79
  5.1 结论  76-78
  5.2 建议  78-79
参考文献  79-88
致谢  88-89
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  89

PMA-qPCR选择性检测水中活性菌方法的研究与应用

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