学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

喹乙醇单克隆抗体的制备及其免疫学快速检测方法的建立

作　者: 宋春美
导　师: 张改平；侯玉泽
学　校: 河南科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 喹乙醇单克隆抗体快速检测
分类号: S859.84
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 117次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载

内容摘要

喹乙醇（Olaquindox,OLA）是化学合成的喹噁啉类广谱抗菌药物,具有蛋白同化作用,可提高饲料转化率与瘦肉率,促进动物生长,也可用于预防和治疗细菌感染性疾病。但是在生产实践中,喹乙醇的不规范使用不仅直接危害动物机体的健康,还可以通过食物链对人类健康造成极大的危害。随着科学技术的发展和国家的重视,其检测方法也不断发展。目前已有电化学分析法、光谱法、色谱法、液相色谱-质谱联用技术、免疫分析技术等检测方法。为了建立快速、灵敏的喹乙醇残留免疫学分析方法,本研究在分析喹乙醇免疫学特性的基础上,运用单克隆抗体技术制备了喹乙醇单克隆抗体,并组装了间接竞争ELISA试剂盒。主要研究结果如下:1.喹乙醇人工抗原的制备与鉴定琥珀酸酐法合成衍生物喹乙醇-半琥珀酸酯（OLA-HS）;活化酯法合成全抗原OLA-BSA、OLA-OVA,紫外分光光度法（UV）、凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定;用OLA-BSA免疫BALB/c小鼠,间接ELISA测定多抗血清效价,间接竞争ELISA鉴定其敏感性、特异性。紫外扫描图谱显示合成的人工抗原的最大吸收峰发生偏移,证明偶联成功,并测得OLA-BSA、OLA-OVA中OLA-HS和BSA、OVA的分子结合比分别为分别为17.1:1和12.4:1;SDS-PAGE结果表明BSA的泳动速度大于OLA-BSA,说明OLA-BSA的分子量大于BSA,进一步说明OLA-HS与BSA偶联成功。3#小鼠抗血清的效价最高,对OLA的半数抑制浓度（IC50）为58.923 ng/mL,与卡巴氧的交叉反应率为1.841%,与其他药物无交叉反应。通过实验获得了高价、敏感、特异的多克隆抗体（pAb）。2.喹乙醇单克隆抗体的制备及免疫学特性的鉴定间接ELISA和间接竞争ELISA选择细胞融合备用鼠;杂交瘤技术制备喹乙醇单克隆抗体（OLAmAb）,并对其效价、亲和力、敏感性、特异性、亚型进行鉴定;体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体。筛选出了2B1、4F5、4E12、5B5、5E5五株敏感特异的杂交瘤细胞;鉴定单抗亚型均为IgG1;细胞培养上清间接ELISA效价在1:3.0×102¹:1.28×10³之间,4E12细胞株制作的腹水效价为1:5.12×10⁵,OLAmAb亲和常数Ka为3.75×10¹⁰L/moL,对OLA的IC50为1.66ng/mL;与卡巴氧的交叉反应率为5.19%,与其它类药物无交叉反应。通过试验获得了高效价、敏感、特异的OLAmAb,可用于动物性食品中OLA的残留检测的免疫学试验。3.喹乙醇残留免疫学快速检测方法的建立根据酶联免疫吸附试验原理,应用OLAmAb研制出OLA残留快速检测间接竞争ELISA试剂盒（OLA-Kit）,OLA-Kit的标准曲线呈S型,符合4参数logit曲线拟合,最低检测限为0.126μg/L,半数抑制浓度IC50为1.66ng/mL,平均批内和批间变异系数小于<15%。对猪肝、猪肉分别添加2、10、50、100ng/mL OLA标准品,平均回收率分别为77.6%和79.68%。OLA-Kit性能稳定,在4℃可保存6个月。

全文目录

摘要  2-4
ABSTRACT  4-9
第1章文献综述  9-18
  1.1 喹乙醇概述  9-10
    1.1.1 喹乙醇的化学性质  9-10
    1.1.2 喹乙醇的理化性质  10
    1.1.3 喹乙醇的吸收和代谢  10
  1.2 喹乙醇的危害  10-13
    1.2.1 急性毒性  10-11
    1.2.2 蓄积毒性  11-12
    1.2.3 遗传毒性  12-13
    1.2.4 免疫毒性  13
    1.2.5 生态毒性  13
  1.3 喹乙醇的检测方法  13-16
    1.3.1 电化学分析法  13-14
    1.3.2 光谱法  14
    1.3.3 色谱法  14-15
    1.3.4 液相色谱-质谱联用技术  15
    1.3.5 免疫分析技术  15-16
  1.4 本研究的目的及意义  16
  1.5 本研究的主要内容及技术路线  16-18
    1.5.1 主要内容  16-17
    1.5.2 技术路线  17-18
第2章喹乙醇人工抗原的合成与鉴定  18-29
  2.1 材料  18-19
    2.1.1 试剂与溶液  18
    2.1.2 实验动物  18
    2.1.3 主要仪器  18-19
  2.2 方法  19-22
    2.2.1 琥珀酸酐法合成OLA-HS  19
    2.2.2 活化酯法合成OLA 人工抗原  19-20
    2.2.3 UV 鉴定OLA 人工抗原  20
    2.2.4 SDS-PAGE 法鉴定OLA 人工抗原  20-21
    2.2.5 OLApAb 的制备  21
    2.2.6 OLApAb 的鉴定  21-22
  2.3 结果  22-26
    2.3.1 OLA-HS 的质谱鉴定结果  22
    2.3.2 OLA 人工抗原的UV 鉴定结果  22-24
    2.3.3 OLA 人工抗原的SDS-PAGE 鉴定结果  24
    2.3.4 OLA pAb 的鉴定结果  24-26
  2.4 讨论  26-28
    2.4.1 关于OLA 人工抗原的合成  26
    2.4.2 关于载体蛋白的选择  26-27
    2.4.3 关于小分子偶联比  27-28
    2.4.4 关于动物选择和动物免疫的方法  28
    2.4.5 关于OLA 人工抗原的鉴定  28
  2.5 本章小结  28-29
第3章喹乙醇单克隆抗体的制备及其免疫学特性的鉴定  29-40
  3.1 材料  29-31
    3.1.1 试剂与溶液  29-30
    3.1.2 主要仪器  30
    3.1.3 试验动物和瘤细胞  30-31
  3.2 方法  31-34
    3.2.1 杂交瘤细胞株的建立  31-33
    3.2.2 OLAmAb 的生产  33
    3.2.3 OLAmAb 的免疫学特性鉴定  33-34
  3.3 结果与分析  34-36
    3.3.1 杂交瘤细胞株的建立  34
    3.3.2 效价测定结果  34
    3.3.3 亲和力鉴定结果  34-35
    3.3.4 敏感性鉴定结果  35
    3.3.5 交叉反应试验结果  35-36
    3.3.6 亚型鉴定结果  36
  3.4 讨论  36-38
    3.4.1 关于细胞融合  36-37
    3.4.2 关于杂交瘤细胞株的筛选  37-38
    3.4.3 关于OLAm Ab 的大量制备  38
    3.4.4 关于OLAm Ab 免疫学特性的鉴定  38
  3.5 本章小结  38-40
第4章喹乙醇残留检测间接竞争 ELISA 试剂盒的研制  40-52
  4.1 材料  40
  4.2 方法  40-43
    4.2.1 喹乙醇检测间接竞争ELISA 试验条件的优化及方法的建立  40-41
    4.2.2 OLA-Kit 的配置、操作步骤及结果判定  41-42
    4.2.3 样品的预处理  42
    4.2.4 OLA-Kit 的性能测定  42-43
  4.3 结果与分析  43-50
    4.3.1 喹乙醇检测间接竞争ELISA 方法的建立及反应条件的优化  43-47
    4.3.2 OLA-Kit 的性能测定  47-50
  4.4 讨论  50-51
    4.4.1 关于ELISA 实验条件的优化  50-51
    4.4.2 关于OLA-Kit 的质量特性  51
  4.5 本章小结  51-52
第5章结论  52-53
参考文献  53-58
缩略语词汇表  58-60
致谢  60-62
攻读硕士学位期间的研究成果  62

喹乙醇单克隆抗体的制备及其免疫学快速检测方法的建立

内容摘要

全文目录

相似论文