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人CYP2E1野生型及CYP2E12、CYP2E13和CYP2E1*4突变体重组酶的表达及其代谢活性研究

作　者: 路珂
导　师: 姚彤炜
学　校: 浙江大学
专　业: 药物分析学
关键词: CYP2E1 突变体杆状病毒表达系统氯唑沙宗 7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素活性鉴定
分类号: R917
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

本课题通过使用杆状病毒-昆虫表达系统异源表达了人CYP2E1野生型蛋白及CYP2E1^*2、CYP2E1^*3和CYP2E1^*4三个有氨基酸变化的突变体蛋白。为药物Ⅰ相代谢的研究提供了单一性的酶源,同时也将CYP2E1野生型蛋白与突变体之间的代谢动力学参数进行对比。目的表达CYP2E1野生型蛋白及CYP2E1^*2、CYP2E1^*3和CYP2E1^*4三个突变体蛋白,比较它们之间的代谢动力学差异,同时为药物Ⅰ相代谢的研究提供单一性的酶源。方法以人肝组织RNA为模板进行RT-PCR扩增反应,获得CYP2E1基因的cDNA序列,然后通过定点突变获得三个突变体的cDNA序列。将这些基因分别连接至pGEM-T载体上并进行DNA测序,选取正确序列的CYP2E1野生型及三个突变型基因,与pFastBac质粒连接,得到的重组质粒转化入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经过转座作用,产生重组粘粒DNA（Bacmid-CYP2Els）。该重组粘粒转染Sf9细胞后,即产生重组杆状病毒。将构建好的CYP2E1病毒,与本实验室已构建好的CYPOR、CYPb5病毒一起加入Sf9细胞中共表达这三种蛋白以获得有代谢活性的重组酶。通过测定共表达方法中三种病毒间不同的比例、不同的细胞感染复数值,以及不同的表达时间等条件下的活性,选取最佳表达条件。以氯唑沙宗和7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素作为底物,分别检测重组酶的活性,并比较CYP2E1野生型与突变体之间的代谢动力学参数。结果对构建各CYP2E1s重组病毒的每个步骤的鉴定,表明本实验成功构建了含有正确目的基因序列的各重组CYP2E1s病毒。将各重组CYP2E1s病毒分别感染Sf9细胞,通过RT-PCR实验表明目的基因在mRNA水平上有表达;通过western blot实验表明目的蛋白在蛋白水平有表达。以氯唑沙宗和7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素为底物,分别对重组酶的代谢活性进行检测,表明构建的CYP2E1野生型及CYP2E1^*2、CYP2E1^*3和CYP2E1^*4突变体重组酶都有代谢活性,它们对氯唑沙宗的代谢动力学参数K_m分别为72.4、40.83、37.16和32.66μmol·L^-1,V_max分别为0.402、0.374、0.356和0.354μmol·min^-1·g^-1protein;对7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素的代谢动力学参数K_m分别为35.3、10.6、19.2和14.22μmol·L^-1,V_max分别为0.023、0.034、0.036和0.033μmol·min^-1·g^-1protein。结论CYP2E1野生型与CYP2E1^*2、CYP2E1^*3和CYP2E1^*4突变体重组酶的代谢活性无明显差别,但三个突变体对底物的亲和性比野生型高。本实验所构建的重组酶可用于体外药物代谢研究。

全文目录

致谢  4-6
摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
英文缩略词表  10-11
引言  11-12
实验材料  12-20
  1 菌株  12
  2 质粒  12
  3 细胞系  12
  4 分子生物学试剂  12-13
  5 生化试剂  13
  6 化学试剂  13
  7 底物标准品  13
  8 仪器设备  13-14
  9 试剂配置  14-20
实验方法  20-34
  1 含有人CYP2E1*1及*2、*3、*4突变体基因的杆状病毒的构建  20-28
  2 人CYP2E1重组蛋白的生物学表征  28-29
  3 重组蛋白的共表达及条件优化  29-30
  4 活性鉴定  30-34
实验结果  34-49
  1 重组病毒的构建  34-37
  2 重组病毒表达的鉴定  37-39
  3 共表达条件的优化  39-40
  4 代谢活性鉴定  40-49
讨论  49-51
总结  51
参考文献  51-54
综述细胞色素P450 2E1的研究进展  54-64
在读期间发表的论文  64

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