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晚期糖基化终产物诱导内皮细胞紧密连接形态学改变机制的研究

作　者: 李强
导　师: 黄巧冰
学　校: 第一军医大学
专　业: 病理生理学
关键词: 晚期糖基化终产物内皮细胞紧密连接带状闭合蛋白-1 血管通透性丝裂原活化蛋白激酶
分类号: R361
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

目的：晚期糖基化终产物(advanced glycation end products，AGEs)是一组在体内糖的醛基与蛋白质的氨基之间发生的非酶性糖基化反应的终产物的总称。有研究证明：AGEs在糖尿病血管并发症、动脉硬化、肾病、老年性痴呆症以及衰老的发生发展起重要的作用，而血管通透性升高则是AGEs所致血管病变的早期和主要的病理生理基础。然而，参与其中的机制尚未完全阐明。一般情况下，血管通透性的调节主要是通过细胞间连接以及细胞—基质间的锚定作用和内皮细胞自身的收缩产生的向心力间的动态平衡来实现的。自身收缩力增大或连接破坏都会引起血管通透性升高。内皮细胞紧密连接(tight junction，TJ)是由多种跨膜蛋白[包括咬合蛋白(occludin)、闭合蛋白(claudin-1、claudin-2、claudin-5)]、TJ相关膜周边蛋白[包括胞质带状闭合蛋白(ZO-1、ZO-2、ZO-3)，扣带蛋白(cingulin)，rab13等]和连接黏附分子(junctional adhesion molecule，JAM)等组成的复合物。相邻细胞膜表面occludin和claudin各自同型间相互密切结合，这两种蛋白又通过包括ZO-1在内的周边蛋白与肌动蛋白相作用，形成闭锁的细胞间连接。细胞间连接的解离会导致细胞间隙的形成，从而引起内皮通透性的升高。本课题的研究目的是探讨AGEs对内皮细胞紧密连接ZO-1和纤维状肌动蛋白(Filamentous actin，F-actin)的形态学影响，并对其作用机制作初步研究，为相关疾病的发生机制提供更系统的实验数据，为临床治疗提供新的思路。方法：培养人脐静脉内皮细胞，用免疫荧光染色的方法显示ZO-1和F-actin在内皮细胞分布的形态和部位。AGE修饰的人血清白蛋白(AGE-modified human serum albumin，AGE-HSA)，由人血清白蛋白与葡萄糖共孵育8周制得。观察AGE-HSA以不同浓度(12.5、25、50、100 mg／L)和不同时间(2、4、8、24 h)作用下，内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1和F-actin的形态学变化，查明AGEs引起内皮细胞ZO-1和F-actin形态改变的剂量和时间效应。通过选用Rho激酶的特异性抑制剂Y-27632探讨Rho激酶在AGEs诱导内皮细胞ZO-1和F-actin形态改变中的作用。分别使用ERK通路抑制剂PD98059、p38 MAPK通路抑制剂SB203580预处理人脐静脉内皮细胞；另外分别使用相关特异蛋白突变体重组腺病毒转染内皮细胞，来探讨ERK通路和p38 MAPK通路在AGEs介导的内皮细胞ZO-1和F-actin形态学变化中发挥的作用。以上变化通过激光共聚焦显微镜观察。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western blot)的方法检测AGEs刺激内皮细胞对ERK和p38 MAPK磷酸化的水平的影响，为形态学结果提供进一步证明。结果：1．正常对照组的内皮细胞ZO-1存在于细胞周边呈环状，线条清晰连续，边缘光滑流畅。AGEs作用于内皮细胞引起ZO-1形态的明显变化，ZO-1环线条变得模糊，呈断裂状，边缘粗糙有毛刺状突起，细胞内染色增多，且这种变化的程度随着AGEs作用浓度的增加(12.5-100 mg／L)和作用时间的延长(2-24 h)逐渐加深。其中以50 mg／L AGEs作用细胞8 h变化最为明显。正常条件下F-actin分布在细胞周边形成actin环，结构紧密，边界清晰，细胞间无间隙。AGEs作用于内皮细胞导致actin环出现断裂，细胞界限模糊，此变化的程度亦随AGEs作用浓度的增加和作用时间的延长逐渐加强。2．用Rho激酶抑制剂Y27632预处理细胞30 min后，可明显降低AGEs对紧密连接蛋白ZO-1和F-actin分布和形态的影响。3．分别用ERK通路抑制剂(PD98059)或p38 MAPK通路抑制剂(SB203580)预处理细胞30 min后，均可显著减轻AGEs对ZO-1和F-actin的影响。4．分别以含显性失活(dominant negative，DN)的ERK上游激酶MEK1或p38 MAPK上游激酶MEK6b的重组腺病毒预先转染内皮细胞12 h，均可减轻AGEs对紧密连接蛋白ZO-1和F-actin分布和形态的影响；而含组成型激活(constitutive active，CA)MEK1或MEK6b突变体的重组腺病毒本身作用细胞即可引起内皮细胞ZO-1和F-actin分布和形态的变化。5．Western blot研究结果显示，50 mg／LAGEs刺激细胞8h能引起内皮细胞p38 MAPK磷酸化水平的升高。用Rho激酶抑制剂Y-27632预处理细胞30 min后，可降低AGEs诱导的内皮细胞p38 MAPK磷酸化水平的升高。结论：1．实验证明，AGEs以剂量和时间依赖的方式引起内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1和F-actin形态和分布改变。2．Rho激酶参与了AGEs引起的内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1和F-actin形态和分布的改变。3．AGEs刺激可以引起内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1和F-actin形态和分布改变，这一作用可能是由ERK及p38 MAPK信号通路介导的。4．AGEs可诱导内皮细胞p38 MAPK激活，而Rho激酶抑制剂Y-27632预处理细胞，可降低AGEs引起内皮细胞p38 MAPK磷酸化水平的升高，说明Rho激酶可能在p38 MAPK通路上游发挥作用。

全文目录

摘要  3-6
英文摘要  6-10
前言  10-14
材料与方法  14-20
结果  20-31
讨论  31-37
结论  37-38
参考文献  38-44
附录(英文缩写词表)  44-45
硕士期间撰写和发表的论文  45-46
致谢  46-47

晚期糖基化终产物诱导内皮细胞紧密连接形态学改变机制的研究

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