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木质纤维转化乙醇优势菌的筛选和优化

作　者: 曾盈宇
导　师: 陈介南；何钢
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 木质纤维素木糖乙醇发酵
分类号: TQ223.122
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 62次
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内容摘要

全球经济的高速发展导致以石油为代表的不可再生的各类矿物质资源日益短缺,寻找可再生性能源成为必然的趋势。燃料乙醇是公认的最有发展前景的可再生清洁能源之一。以木质纤维素类生物质生产燃料乙醇不仅能够降低燃料乙醇生产成本,同时对废物处理、环境保护等方面起到一定的作用。木糖是木质纤维素水解物中含量仅次于葡萄糖的一种单糖。木糖的有效利用是木质纤维素生物转化生产乙醇的关键环节之一。因此,高糖利用率和高耐抑制物能力的木糖发酵菌种的选育一直是该领域的热门课题。本论文以微生物学的理论为基础,根据木糖发酵菌的特点,从自然环境中分离筛选出一株高效发酵木糖产乙醇的菌株,根据菌株的生理生化特性和分子生物学手段对该菌株进行了鉴定。同时对其发酵木糖生产乙醇的工艺进行了参数优化,为该菌株在纤维素生产燃料乙醇的应用奠定了一定基础。其主要研究内容如下：1.发酵木糖产乙醇细菌的分离、筛选及鉴定采用以木糖为唯一碳源的木糖筛选平板分离法,从富含腐烂纤维素的土壤中筛选出22株木糖发酵菌株。在以木糖为唯一碳源的发酵培养基上进行木糖发酵实验,以乙醇产量为指标,根据检测结果,最终筛选出一株高效木糖发酵菌株,命名为菌株18。对该株菌进行形态学和生理生化学的鉴定,并结合其16s rDNA序列鉴定结果表明,该菌株与蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的16s rDNA的序列同源性高达100%,确定其为蜡状芽孢杆菌。2.发酵木糖产乙醇细菌的理化性质研究对菌种18的耐受性研究表明,菌株18适应的pH值范围比较宽,在pH值为4.5～10.0的培养基都能生长,其中在pH值为6.0-8.5的范围内生长比较良好；其适应的NaCl浓度范围也比较宽,在NaCl浓度为5～40g/L范围内的培养基上都能生长,在NaCl浓度为15g/L时生长最好。其氧化酶、过氧化氢酶和硝酸盐还原实验均成阳性。3.发酵条件的优化该菌株可以分别利用木糖和葡萄糖发酵产乙醇,在厌氧条件下,发酵木糖的最大乙醇产量为6.36954g乙醇/90g木糖,是其理论产量的20.11%；发酵葡萄糖的最大乙醇产量为7.14627 g乙醇/90g葡萄糖,是其理论产量的21.19%。这一特点对于木质纤维素水解产物中葡萄糖和木糖的发酵具有理论意义,同时对于木质纤维素生产燃料乙醇的应用具有一定价值。在木糖发酵培养基的基础上,进行菌株发酵参数的优化。菌株18在以木糖为唯一碳源时,温度32℃,木糖30g/L的厌氧条件下培养72h,乙醇产率最高,达到其发酵木糖生成乙醇理论产率的32.24%,此时伴有一定量的酸生成,其pH值为3.32。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
第一章绪论  12-26
  1.1 引言  12
  1.2 燃料乙醇的发展现状及研究意义  12-15
    1.2.1 燃料乙醇的发展现状  12-13
    1.2.2 燃料乙醇的研究意义  13-15
  1.3 木质纤维生产燃料乙醇的研究概述  15-19
    1.3.1 木质纤维生物质的化学组成  15-16
    1.3.2 木质纤维素转化乙醇的技术路线  16-19
  1.4 木糖发酵生产燃料乙醇  19-24
    1.4.1 木糖发酵机理  20-21
    1.4.2 木糖代谢菌株  21-23
    1.4.3 木糖代谢菌株的选育及现状  23-24
  1.5 本研究的意义和主要内容  24-26
    1.5.1 本研究的意义  24
    1.5.2 本研究的主要内容  24-26
第二章发酵木糖产乙醇细菌的筛选  26-32
  2.1 材料与方法  26-28
    2.1.1 材料  26-27
    2.1.2 方法  27-28
  2.2 实验结果与分析  28-31
    2.2.1 分离纯化结果  28
    2.2.2 筛选结果  28-29
    2.2.3 气相色谱标准曲线及分析结果  29-31
  2.3 小结与讨论  31-32
第三章理化性质测定  32-39
  3.1 实验材料  32
    3.1.1 实验仪器  32
    3.1.2 菌株  32
    3.1.3 培养基  32
  3.2 菌株18的形态学观察  32-33
  3.3 生理生化特征  33-34
    3.3.1 生长曲线  33
    3.3.2 NaCl浓度对生长的影响  33
    3.3.3 pH值对生长的影响  33
    3.3.4 温度对生长的影响  33
    3.3.5 不同碳源发酵试验  33
    3.3.6 氧化酶实验  33
    3.3.7 过氧化氢酶实验  33
    3.3.8 硝酸盐还原实验  33-34
  3.4 实验结果及分析  34-38
    3.4.1 菌株18的形态学特征  34
    3.4.2 生理生化特征  34-38
  3.5 小结与讨论  38-39
第四章发酵木糖产乙醇细菌的分子鉴定  39-48
  4.1 实验材料  39-42
    4.1.1 实验仪器  39
    4.1.2 菌株  39
    4.1.3 主要试剂  39-40
    4.1.4 培养基  40
    4.1.5 试剂及溶液的配制  40-42
  4.2 实验方法  42-44
    4.2.1 总DNA的提取  42
    4.2.2 16s rDNA片段扩增  42-43
    4.2.3 DNA纯化  43
    4.2.4 质粒载体与目的DNA连接和鉴定  43-44
    4.2.5 16s rDNA序列测定与分析  44
  4.3 实验结果与分析  44-46
    4.3.1 总DNA提取  44
    4.3.2 16s rDNA片段扩增  44-45
    4.3.3 菌株18重组质粒的构建和鉴定  45
    4.3.4 菌株18 16s rDNA序列测定与分析  45-46
  4.4 小结与讨论  46-48
第五章发酵木糖产乙醇条件的优化  48-65
  5.1 实验材料  48-49
    5.1.1 菌种  48
    5.1.2 培养基  48
    5.1.3 主要实验仪器  48-49
  5.2 实验方法  49-54
    5.2.1 发酵液中乙醇含量的测定  49-50
    5.2.2 发酵液中还原糖含量的测定  50-52
    5.2.3 发酵温度对菌株发酵木糖产乙醇的影响  52
    5.2.4 发酵时间对菌株发酵木糖产乙醇的影响  52-53
    5.2.5 底物浓度对菌株发酵产乙醇的影响  53
    5.2.6 摇床转速对菌株发酵木糖产乙醇的影响  53
    5.2.7 发酵条件优化  53-54
  5.3 实验结果与分析  54-63
    5.3.1 发酵温度对菌株发酵木糖产乙醇的影响  54-56
    5.3.2 发酵时间对菌株发酵木糖产乙醇的影响  56-57
    5.3.3 底物浓度对菌株发酵木糖产乙醇的影响  57-61
    5.3.4 摇床转速对菌株发酵木糖产乙醇的影响  61-62
    5.3.5 发酵条件优化  62-63
  5.4 小结与讨论  63-65
第六章结论与讨论  65-67
  6.1 结论  65
  6.2 本论文的主要创新点  65
  6.3 讨论  65-67
参考文献  67-74
附录A:菌株18的16s rDNA基因片段测序报告(部分)  74-75
附录B:菌株18 B1ast Tree View  75-76
附录C:登录NCBI检索16s rDNA全长的网页  76-77
附录D:缩略词表  77-79
附录E:攻读硕士学位期间的主要学术成果  79-80
致谢  80

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