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类法尼醇X受体（Farnesoid X Receptor, FXR）,在1995年作为一种孤儿核受体被发现,因其转录活性可被超生理浓度的法尼酯增强而命名。生理浓度下的多种初级和次级胆汁酸,以及一些多不饱和脂肪酸可激活FXR,其中以鹅脱氧胆汁酸（chenodexycholic acid, CDCA）为FXR的最适天然配体。对FXR的研究主要集中在胆汁酸代谢,脂代谢及糖代谢,最近发现FXR与动脉粥样硬化发生发展也密切相关。FXR主要在肝、小肠、肾上腺皮质高表达,而在内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞中有少量表达。单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein–1, MCP-1）是一种单核细胞趋化因子,多种细胞都表达MCP-1,如平滑肌细胞,内皮细胞,单核/巨噬细胞等。经炎症因子刺激,MCP-1的表达显著升高,其特异作用于单核/巨噬细胞。MCP-1通过与其特异性高亲和力受体结合,而定向趋化靶细胞。此外,MCP-1还可激活单核细胞产生多种细胞因子,参与多种与炎症相关的反应,与肿瘤、动脉粥样硬化等疾病的发生发展密切相关。近年来对MCP-1转录水平的调控研究越来越多,主要围绕核受体NF-κB,SP1,AP-1对MCP-1的启动子区的调节,孤儿核受体如LXR,PPARs对MCP-1的负调控也有报道。本实验就FXR在小鼠巨噬细胞株ANA-1中的表达及功能进行研究,FXR激活后可下调MCP-1的表达,并对下调机制进行了初步研究,为进一步研究FXR在炎症和AS发生的分子机制中的作用奠定了基础。本研究主要结果总结如下:1. FXR的RT-PCR分析表明,FXR在小鼠巨噬细胞株ANA-1中稳定转录,PCR产物经测序,与GenBank中给出的小鼠FXR cDNA片段（NM009108）一致。Western blot分析在蛋白水平证明了FXR在ANA-1中稳定表达。同时免疫组化结果表明FXR定位于ANA-1细胞的胞质和胞核中。在FXR天然配体CDCA刺激下,ANA-1细胞中FXR的蛋白水平随CDCA浓度的增加（0,25,50,100μM）,呈依耐性升高。2. MCP-1的RT-PCR分析表明,CDCA（50μM）处理ANA-1细胞12或24h后,MCP-1的转录水平降低,同时RT-PCR,Real-time PCR,Western blot和ELISA结果表明MCP-1的mRNA和蛋白水平也随CDCA浓度的增加（0,25,50,100μM）,呈剂量依耐性降低。3.提取ANA-1细胞基因组DNA,PCR扩增小鼠MCP-1基因5`侧翼启动子序列（包含远端、近端调控区和只含近端调控区两段）构建荧光素酶报告基因重组质粒pmMCP-1-Luc1（-2642 +82）与pmMCP-1-Luc2（-322 +82）,并利用脂质体,同FXR和RXR真核表达质粒瞬时共转染HEK293细胞,CDCA处理24小时后,检测各组报告基因表达活性。结果显示FXR被其配体CDCA（50μM）激活后,下调两个小鼠MCP-1启动子片段的转录活性,且下调幅度相当。本研究在小鼠巨噬细胞株ANA-1中检测到孤儿核受体家族成员FXR的表达,且FXR被其天然配体CDCA激活后,其蛋白水平存在配体依赖的正反馈调节。为了进一步探讨其功能,我们发现FXR天然配体CDCA处理下,ANA-1细胞中MCP-1的表达显著下调。通过报告基因分析MCP-1启动子活性发现,FXR可能通过直接或间接的机制下调MCP-1基因的转录水平。
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