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肺炎嗜衣原体（Chlamydophila,C.pneumoniae,缩写Cpn）是一种常见的呼吸道病原体,所致疾病最常见的是肺炎和支气管炎,近年来诸多研究表明其与动脉粥样硬化综合症,哮喘等疾病有关。由于Cpn为严格胞内寄生性,分离培养较为困难,从而影响深入研究Cpn的致病机制、特异性诊断和疫苗的开发。本文应用进口Cpn菌株,通过建立Cpn感染细胞技术,获取大量Cpn抗原,制备斑点抗原片,用于微量免疫荧光染色（Micro-immunofluorescence,MIF）检测血清抗体。同时根据Cpn主要外膜蛋白（Major outer membrane protein,MOMP）核苷酸序列,构建MOMP/pQE31重组质粒,制备MOMP重组抗原,用于ELISA检测诊断Cpn感染。通过对以上检测结果的分析,较为客观的评定每种方法的血清抗体特异性和敏感性,以便用于辅助Cpn感染的临床诊断,探寻Cpn感染与疾病的因果关系。论文第一部分应用进口Cpn菌株,感染Hep-2细胞,分别以瑞氏-姬母萨染色、吖啶橙（Acridine Orange,AO）染色和直接免疫荧光（Direct Immunofluorescence,DIF）染色三种方法鉴定Cpn感染细胞。Cpn感染Hep-2细胞的最适条件是用含1ug/ml放线菌酮的维持液,在35℃5%CO2孵箱中培养7天,并在培养的第0,3,4,5天作2600rpm/min离心1h,感染成功率极高。染色反应显示,瑞氏-姬母萨染色可将Cpn包涵体染成蓝紫色或红紫色;吖啶橙染色则显示Cpn感染的Hep-2细胞呈现鲜明的橘红色;免疫荧光抗体染色后,在Cpn感染细胞内可见亮苹果绿色包涵体。论文第二部分是将Cpn抗原用于制备斑点抗原片。通过建立MIF检测血清抗体,诊断Cpn感染。用Cpn抗原片和外周血单核细胞（Peripheral BloodMononuclear Cell,PBMC）抗原片分别检测100份病人血液标本。结果显示:用Cpn抗原片检测血清IgG抗体,阳性率为61%;用PBMC抗原片检测,阳性率60%。经统计,两者阳性检出率无明显差异。用Cpn感染细胞制作的Cpn斑点抗原片可用于临床检测血清Cpn-IgG抗体,且具有特异性、敏感性高的特点。论文第三部分通过构建和表达Cpn MOMP重组抗原,应用包涵体纯化法纯化重组抗原后建立ELISA试验,并检测了82份正常人血清及临床标本207份,其中心血管疾病血清118份,呼吸系统疾病血清59份,其他疾病30份。用重组抗原检测血清IgG,正常人血清阳性检出率仅为3.7%;而207份病人血清,116份为阳性,总阳性率56.0%。其中心血管疾病血清118份,阳性69份,阳性率58.5%;呼吸系统疾病血清59份,阳性38份,阳性率64.4%;其他疾病患者30份,阳性9份,阳性率仅30.0%。与进口ELISA试剂盒及Cpn全抗原相比,阳性率基本相符,统计分析无显著意义,但重组MOMP蛋白的抗原特异性较高,且具有抗原制备较为方便和价廉等特点。本课题通过细胞培养技术制备获得大量Cpn,经瑞氏-姬母萨染色、吖啶橙染色、免疫荧光抗体染色鉴定证实为Cpn抗原。将纯化的Cpn抗原制成抗原片,通过Cpn抗原片与PBMC抗原片检测血清抗体的比较,经统计显示阳性检出率无明显差异。表明Cpn抗原片检测法具有较好的敏感性和特异性,可用于临床辅助诊断。制备重组MOMP抗原用于ELISA检测血清抗体,结果显示正常人及病人血清抗体效价有明显差异,且与进口试剂盒及全抗原检测阳性率基本相符。以重组蛋白MOMP为基础建立的ELISA方法灵敏度和特异性高,可用于Cpn感染的诊断和所致疾病的研究,具有重要的临床意义和学术价值。
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