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肺炎嗜衣原体(chlamydophila pneumoniae, Cpn)是严格的细胞内寄生菌,1965年首次从台湾一名儿童患者的眼结膜中分离得到,1989年被命名为肺炎衣原体,2004年更名为肺炎嗜衣原体。与其他衣原体一样,Cpn具有独特的发育周期,具有感染能力强、对外界环境耐受、电子致密的原体(elementary body, EB)形态,感染宿主细胞后,发育成代谢活跃的网状体(reticulate body, RB)形态,感染后几个小时,经过二分裂繁殖形成大量的EB,细胞破裂后释放出新的EB感染新的宿主细胞。Cpn是在世界范围内引起咽炎、窦炎、支气管炎和10%～15﹪社区获得性肺炎的呼吸道传染病原菌,大约50﹪的人在20岁之前感染过Cpn,再次感染也很普遍。近年来Cpn得到更多的关注是因为它与人类许多慢性疾病有关,如动脉硬化症、心血管疾病、脑膜炎、多重硬化症和哮喘等。主要外膜蛋白(major outer membrane protein, MOMP)是衣原体特征抗原之一,占衣原体外膜蛋白的60%以上,在EB和RB中都存在。编码Cpn MOMP的基因ompA开放读码框有1167个bp组成,与沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)L2型ompA基因和鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila Psittaci,Cps)羊流产株ompA基因分别有68%和71%的同源性,编码的氨基酸序列分别有73%和80%的同源性。Cpn MOMP包含4个可变区(variable domain,VD)和5个保守区,在保守区含有7个保守的半胱氨酸残基,其形成的二硫键是维持MOMP高级结构的重要组成部分。通过Cpn不同菌株VDⅣ序列和MOMP全序列的比较,Cpn MOMP具有高度的保守性。Cpn MOMP是Cpn感染中的重要免疫原,能在Westen Blot试验中被Cpn感染的病人血清识别。由于Cpn培养困难,无法通过提取和纯化大量获得天然Cpn-MOMP,因此研究者试图通过基因工程的方法获得重组Cpn MOMP(rCpn-MOMP),用作Cpn感染诊断和疫苗研究。本课题根据NCBI网站公布的Cpn OmpA基因序列设计引物,用ATCC VR1360 Cpn菌株基因组作为模板,PCR扩增得到OmpA开放读码框除前导肽以外的序列。经1%琼脂糖凝胶电泳分析,扩增产物大小为1100bp,与预期值一致。扩增产物与pMD18T载体构建克隆质粒pMD18T-MOMP,化学转化感受态细胞JM109,对克隆菌株经过PCR筛选、限制性内切酶NcoⅠ和SalⅠ双酶切鉴定,结果表明获得的pMD18T-MOMP含有扩增得到的目的基因片段。pMD18T-MOMP双酶切获得MOMP片段与同样双酶切的pET32a片段构建表达质粒pET32a-MOMP,转化BL21(DE3)感受态细胞得到重组表达工程菌株。鉴定结果显示,插入目的片段正确,由于融合了硫氧还蛋白,得到的rCpn-MOMP分子量为56KDa,测得表达质粒序列全长1738bp,其中64-1644bp为开放读码框,编码527个氨基酸。此序列经NCBI BLAST与已知序列比对,一致率99%,其中第873位碱基突变,突变的碱基所在的密码子由TTT变为TTC,仍编码phe,开放读码框正确,保证了rCpn-MOMP一级序列的准确性。摸索了构建的工程菌株诱导表达rCpn-MOMP的最佳条件,发现温度对诱导表达的效果影响显著,当温度为28℃时,IPTG终浓度1mM诱导4.5h,可获得rCpn-MOMP以包涵体形式高效表达,表达量占菌体蛋白的53%。包涵体经洗涤后用8M尿素变性,梯度浓度透析复性,纯化的rCpn-MOMP纯度可达90%以上,每升LB培养基可获得纯蛋白350mg。在WB实验中,rCpn-MOMP能被鼠抗Cpn抗体识别,说明rCpn-MOMP具有较好的抗原性。尤其是rCpn-MOMP能与Cpn抗体阳性患者血清在56KDa处产生特异的沉淀线,这一结果为rCpn-MOMP用于Cpn感染诊断和疫苗研究奠定基础。
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