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早在1930s就有研究者在啮齿类动物身上研究限制饮食对动物的影响,发现对啮齿类动物控制饮食后可以使它们的寿命增加。因为限制饮食中主要限制的是热卡,所以研究者们又常常称之为能量摄入限制(calorie restriction,CR)。2000年,Lin SJ等在细胞培养中发现,把培养基中的葡萄糖由2%减少到0.5%或者更少,对酵母菌进行能量摄入限制后,可以使酵母菌的寿命延长30%-40%。Weiss EP等研究发现,CR还可以提高组织对胰岛素作用的敏感性,减少胰岛素抵抗,从而减少胰岛β细胞分泌胰岛素,对2型糖尿病的防治有重要的作用。临床和流行病学调查表明,随年龄增长,糖耐量逐渐下降,T2DM及糖耐量减低(IGT)患病率增高。动物实验也表明,在高脂饮食诱导的2型糖尿病小鼠模型中,β细胞衰老参与了饮食诱导的T2DM的发病。因此,胰岛β细胞衰老参与了T2DM的发生发展,但其具体机制尚未清楚。沉默信息调节因子SIR2(Silent information regulator 2)是调节生物体衰老进程的一个重要基因,首先在酵母细胞中发现,参与了酵母菌交配型基因沉默、端粒区基因沉默和rDNA重组,维持了基因的稳定性,并与物质代谢和长寿有着很大的关系,是依赖NAD+的去乙酰化酶,能够去乙酰化多种底物,从而介导不同生物效应。此外,SIR2在哺乳动物的同源基因SIRT1对哺乳动物β细胞的胰岛素分泌有正向调节作用。研究发现SIR2与CR高度相关,在多种生物体内(如酵母、线虫、果蝇、哺乳动物)CR能启动SIR2及其同源体,使SIR2体内的沉默活性、mRNA水平增加,促其在细胞内高表达,从而延长机体的寿命。胰岛素/胰岛素样生长因子-1(INS/IGF-1)通路(INS/IGF-1-PI3K-AKT-FOXO)是参与衰老和代谢的重要调控通路。FOXO家族是INS/IGF-1通路下游因子,在胰岛素β细胞,FOXO1是INS/IGF-1通路的效应子, FOXO1的失活导致胰腺/十二指肠同源基因-1(pancreas/duodenum homeobox gene-1, Pdx1)表达的增加和β细胞的增殖,进而影响了β细胞的功能, SIRT1可通过去乙酰化作用调节FOXO介导的下游效应,如加强对氧化应激和热应激的反应,使细胞周期停滞,DNA修复增强。本课题前期实验证实,随年龄增长,大鼠胰岛β细胞衰老增加,伴随着胰岛素分泌减少,CR组大鼠胰岛细胞SIRT1表达量高于对照组,反映衰老标志的β-gal染色中,CR组明显低于对照组,证明了热量限制成功诱导了胰岛细胞内SIRT1蛋白的上调,通过增强INS/IGF-1信号通路及其自身的去乙酰化酶活性,抑制了FOXO1的活性,从而降低了FOXO1下游衰老相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达,并同时提高了组织细胞对胰岛素的敏感性,减少了β细胞因过度分泌胰岛素而引起的凋亡,最终延缓了β细胞的衰老。因此我们猜测在哺乳动物胰岛β细胞,CR通过SIRT1进而调节INS/IGF-1通路的PI3K-AKT-FOXO因子,影响β细胞倍增及胰岛素分泌功能,并且参与胰岛素抵抗与T2DM的发生发展。本实验通过热量摄入限制(CR)诱导NIT-1细胞的SIRT1高表达,延缓了胰岛β细胞倍增时间,从体外实验进一步检测胰岛β细胞中SIRT1与INS/IGF-1通路主要因子的相关性,并通过图像采集和分析软件对其表达水平做进一步分析,探讨热量摄入限制影响NIT-1细胞胰岛素分泌的调控通路,为T2DM发病机制提供进提供新的实验依据和理论基础。内容和方法:1.NIT-1细胞正常培养、CR培养至指数生长期及在CR培养同时用SIRT1的抑制剂尼克酰胺(NIC)对NIT-1细胞进行干扰。2.用免疫细胞化学、RT-PCR实验方法检测SIRT1及INS/IGF-1通路主要因子PI3K、AKT、FOXO1的蛋白及mRNA表达水平变化。3.用放射免疫及免疫细胞化学方法检测胰岛素的分泌及表达量的变化,用细胞计数法检测细胞倍增时间的变化。结果:1.CR可使NIT-1细胞倍增时间延长及胰岛素分泌减少。2.CR可以使NIT-1细胞的SIRT1高表达并影响INS/IGF-1信号通路。3.用SIRT1的抑制剂诱导后,可以逆转上述CR的作用。结论:1.能量摄入限制可能通过高表达SIRT1参与了对INS/IGF-1信号通路的调控。2.能量摄入限制延长NIT-1细胞倍增时间,改善了胰岛素分泌功能。
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