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J亚群禽白血病病毒gp37基因siRNA表达载体的构建及体外干扰效应的初步研究

作　者: 孟祥凯
导　师: 成子强
学　校: 山东农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 禽白血病病毒J亚群 gp37基因 siRNA表达载体 RNA干扰
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 140次
引　用: 2次
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内容摘要

本研究以禽白血病病毒J亚群(ALV-J)gp37基因为靶向基因,以RNA干扰的方法,干扰其表达,以达到限制ALV-J在细胞内复制的目的。参照Takara和Ambion公司的成功的经验并利用Ambion公司的在线设计工具httpp:www.ambion.com/techlib/misc/siRNA design html,针对ALV-J NX0101株gp37基因序列(编码跨膜蛋白TM)寻找siRNA靶序列,根据siRNA阴性对照设计原则设计相应的阴性对照。经BLAST验证,所选择的靶序列与鸡体和其它病毒基因片段无同源性。在设计的靶序列5’端开始的19个核苷酸为正义链,中间加入9个核苷酸TTCAA GAGA间隔以形成发夹结构,3’端加有转录终止信号TTTTTT。并且5’端带有BamH I(GATCC)酶切位点,3’端带有Xho I ( CTCGAG)和Hind III(TTCGA)酶切位点。靶序列分别被克隆到psilencer2.1-U6载体上。经Xho I酶切鉴定和测序鉴定后,证明已成功地构建了针对gp37基因不同区域的siRNA(small interfering RNA)表达载体。分别命名为pu6gp 37-1,pu6gp37-2,pu6gp37-3, pu6 gp37-4,pu6gp37-5,pu6gp37-6, pu6gp(阴性对照)。以提取的ALV-J NX0101株病毒基因组DNA为模板,根据Gene Bank上发表的ALV-J NX0101株gp37基因序列设计1对特异性引物,PCR扩增出gp37 (591bp)基因,克隆到pMD18-T Vector。目的片段经双酶切连接到pEGFP-N1载体上,经酶切和测序鉴定后,证明已成功地构建了gp37基因的融合表达载体,命名为pEGFP-gp37。用pEGFP- gp37融合表达载体转染CEF细胞,分别在转染后24h, 48h,72h观察荧光的变化。发现转染后24h就可见到荧光,48h荧光最强,72h荧光逐渐减弱,减少;pEGFP- gp37与构建的针对gp37基因不同区域的siRNA表达载体分别两两共转染CEF细胞后,分别在24h, 48h,72h观察荧光的变化,结果发现,共转染48h后与pu6gp37-2、pu6gp37-4质粒共转染的孔荧光均减弱,荧光细胞数减少,初步验证pu6gp37-2、pu6gp37-4对TM蛋白有抑制作用。本研究为RNAi技术应用于抗ALV-J感染研究奠定了基础并为抗病毒研究提供了新途径。

全文目录

英文缩略表  7-8
中文摘要  8-10
英文摘要  10-12
第一部分文献综述  12-24
  第一章 J 亚群禽白血病及其研状  12-24
    1 J亚群禽白血病  12-13
    2 ALV-J 的分子病毒学特性  13-15
    3 ALV-J 的致病性及其免疫抑制作用  15-18
      3.1 ALV-J 的致病性  15-16
      3.2 ALV-J 的致瘤机制  16-17
      3.3 ALV-J的免疫抑制作用  17-18
    4. ALV-J流行病学  18-20
      4.1 ALV-J 的宿主范围  18-19
      4.2 ALV-J 的传播方式  19-20
    5. J亚群禽白血病的病理变化  20-21
      5.1 临床症状  20
      5.2 组织学变化  20-21
    6 诊断  21-23
      6.1 ALV-J 的分离与鉴定  21-22
      6.2 ALV-J 的PCR 检测  22-23
      6.3 ALV-J 的ELISA 检测  23
    7. ALV-J 的防制  23-24
第二章 RNA 干扰的研究进展  24-35
  1 RNAi 的发现及发展  24-25
  2. RNAi 的作用机制  25-27
  3. RNAi 技术路线及应用  27-31
    3.1 siRNA 设计  28-29
    3.2 siRNA 的制备  29-31
    3.3 siRNA 表达载体体外输送  31
  4 RNAi 在动物病毒性疾病中的研究  31-34
    4.1 RNA 干扰流感病毒的研究  32
    4.2 RNA 干扰马立克氏病毒的研究  32-33
    4.3 RNA干扰口蹄疫病毒的研究  33-34
  5 RNAi 技术的展望与未来  34-35
第二部分研究内容  35-67
  第一章 siRNA 表达载体的构建  35-46
    摘要  35-36
    1 材料  36-38
      1.1 质粒和菌株  36-37
      1.2 工具酶和主要试剂  37
      1.3 引物合成  37-38
      1.4 主要仪器  38
    2. 方法  38-41
      2.1 RNA 靶位点的选择  38
      2.2 siRNA 设计  38
      2.3 插入片段的准备  38-39
      2.4 载体片段的准备  39
      2.5 连接和转化  39-40
      2.6 阳性克隆的筛选和鉴定  40-41
    3. 结果  41-43
      3.1 siRNA 的设计  41-42
      3.2 siRNA 表达载体构建  42
      3.3 重组质粒的序列测定  42-43
    4 讨论  43-45
    5 小结  45-46
  第二章 pEGFP-gp37 融合表达载体的构建  46-60
    摘要  46-47
    1. 材料  47-49
      1.1 质粒和菌株  47
      1.2 工具酶和试剂  47
      1.3 主要仪器  47
      1.4 病毒和细胞  47-49
    2 方法  49-55
      2.1 pEGFP-gp37 重组质粒载体的构建及表达  49-54
      2.2 重组质粒载体的鉴定  54-55
    3 结果  55-58
      3.1 间接免疫荧光检测  55-56
      3.2 gp37 基因的扩增  56
      3.3 pMD-gp37 质粒酶切鉴定结果  56-57
      3.4 序列的测定及同源性比较  57
      3.5 重组质粒载体pEGFP-gp37 的酶切鉴定  57-58
      3.6 重组质粒载体pEGFP-gp37 的测序鉴定  58
    4 讨论  58-59
    5 小结  59-60
  第三章 siRNA 体外干扰gp37 基因的初步研究  60-67
    摘要  60
    1 材料  60-61
      1.1 试剂  60-61
      1.2 主要仪器  61
      1.3 细胞  61
    2 方法  61-63
      2.1 重组质粒pEGFP- gp37 在细胞上的表达  61-63
    3 结果  63-64
      3.1 pEGFP- gp37 融合表达载体转染 CEF 细胞  63-64
      3.2 pEGFP- gp37 和不同的siRNA 表达载体共转染CEF 细胞  64
    4 讨论  64-66
    5. 小结  66-67
全文总结  67-68
参考文献  68-79
附录  79-80
致谢  80-81
攻读学位期间发表的论文  81

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