学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

乳中IgA和IgM含量的变化及其影响因素的机理研究

作　者: 张春刚
导　师: 王加启；赵国琦
学　校: 扬州大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 奶牛 免疫球蛋白 SDS-PAGE DHI 通径分析 相关分析 SNP 单倍型 pIgR基因 小鼠 Real Time PCR
分类号: S852.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 184次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


本试验由四部分组成,主要研究了初乳、常乳和免疫乳血清和乳清中各免疫球蛋白含量的变化规律及其乳清中主要蛋白质的SDS-PAGE分析,并研究了牛乳中IgA和IgM浓度的影响因素,包括奶牛胎次、泌乳阶段、产奶量、体细胞评分（SCS）以及奶牛pIgR基因5’侧翼区的SNP。以小鼠为试验动物模型来探讨奶牛乳腺中IgA和IgM合成转运的机理,研究了小鼠免疫刺激后pIgR基因的表达量及与特异性IgA含量的相关性。具体研究结果如下:试验一:采用埋植抗原缓释剂ARD这一种新型的免疫乳生产技术。选取2胎牛20头,按照泌乳天数、产奶量相近的原则随机分成2组,每组10头,其中10头用于埋植ARD（试验组）,其余为对照（对照组）。采集每头牛的乳样和血样。同时采集奶牛产后0-7 d的初乳乳样（n=20）和产后1 d和5 d的血样。采用夹心ELISA测定血清和乳清中的免疫球蛋白IgG、IgA和IgM的含量。结果表明免疫组奶牛的血清和乳清中的各免疫球蛋白的含量均高于对照组。其中乳清中IgG的含量在9 d、17 d和32 d分别达到最高峰,这与ARD在埋植后0 d、14 d和28 d释放相一致。相反,乳清中的IgA和IgM的含量没有表现出相同的规律。初乳牛1 d的血清中IgM的含量显著高于5 d的含量（p < 0.05）,而IgG和IgA的含量无显著差异。初乳乳清的各免疫球蛋白含量随着泌乳天数的增加而迅速下降,直至维持在较低的水平。SDS-PAGE结果表明,从电泳图谱上可以清晰的看见5个条带,自上而下依次是乳铁蛋白、牛血清白蛋白、IgG重链、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。其中32 d的免疫乳和0-3 d的初乳可以看到IgG的轻链,其它样品IgG轻链条带较弱。0-7 d初乳各乳清蛋白的相对含量随着泌乳天数增加而逐渐下降,在0-5 d内差异显著（p < 0.05）,直至维持在较低水平。免疫乳15 d和32 d各乳清蛋白均高于常乳。试验二:研究了正常泌乳奶牛中IgA和IgM的浓度是否受奶牛胎次、泌乳阶段、产奶量和牛奶体细胞评分（SCS）的影响。从1600多头奶牛群体中随机选择284头奶牛采集其牛奶样品,通过夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定其IgA和IgM的浓度。牛奶中IgA和IgM的浓度（平均数±标准差,对数形式,下同）分别为2.371±0.286和1.499±0.383。4胎以上（含4胎）的奶牛其乳中IgA平均浓度高于1胎、2胎和3胎牛,而3胎牛和4胎牛其乳中IgM的平均浓度差异显著（p < 0.05）;IgA浓度在泌乳前期和泌乳中期较低,而IgM浓度随着泌乳天数的增加而增加;产奶量为20-25 kg和大于30 kg的奶牛其乳中IgA含量较低,但是产奶量并不影响IgM含量;牛奶中IgA和IgM含量都随着SCS的增加而增加。相关分析和通径分析表明,这些因素对牛奶中IgA和IgM的累积效应值分别达到了0.320和0.358。试验三:从NCBI上的Map Viewer数据库下载牛pIgR基因的5’侧翼区的序列（NW174143）,长度为3.2 kb,设计4对引物进行PCR扩增,通过对25头牛的PCR产物直接测序发现SNP位点,采用SNP Stream标签微列阵基因分型系统对189头牛进行基因分型,将其与牛奶和血液中的IgA和IgM的含量进行关联分析。结果表明,在基因-3128、-3072、-2834、-2348和-515位发现了5个SNP位点,其中SNP1和SNP2为A/G突变,SNP3、SNP4和SNP5为T/C突变。方差分析结果表明,SNP1对牛奶IgM和血液IgA含量有显着的影响（p < 0.05）,SNP3和SNP5对血液IgM含量有显着影响（p < 0.05）,其它SNP位点与单倍型组合对乳及血液中IgA和IgM的含量均没有显著影响（p < 0.05）;多重比较分析表明,SNP1位点的基因型AB个体与BB个体的牛奶IgM和血液IgA含量的最小二乘均数差异显著（p < 0.05）;SNP3和SNP5的不同基因型对血液IgM含量的最小二乘均数分别达到了显著水平（p < 0.05）。因此,从研究结果可以看出奶牛pIgR基因5’侧翼区的多态性影响牛奶和血液中的IgA和IgM的含量,这为进一步研究牛奶中IgA和IgM分泌转运机理提供了一定的理论依据。试验四:本试验以小鼠为试验动物来研究乳中IgA的产生转运机理。选择48只健康昆明小白鼠,分为A、B、C、D组,分别于分娩后第4 d注射以下四种疫苗:灭菌生理盐水、Lipase+灭菌生理盐水、空ISCOM和Lipase+ISCOM,每组注射12只,并于分娩后8 d和12 d（即注射后4 d和8 d）采集各小鼠乳样、血样和乳腺组织,用间接ELISA法测定乳样和血浆中的特异性IgA含量,用Real Time PCR检测小鼠乳腺中pIgR基因的相对表达量。结果表明,血浆中特异性IgA的含量差异不显著,而B组和D组中分娩后12 d的乳中特异性IgA含量显著高于8 d乳中的特异性IgA含量（p < 0.05）,Real Time PCR相对定量结果也表明,B组和D组在分娩后12 d的乳腺中pIgR基因的表达量上升。因此,乳腺中pIgR基因表达量增加可以提高乳中特异性IgA的水平,这表明pIgR参与介导IgA跨膜分泌进入乳中,pIgR的数量影响乳中IgA的含量。

全文目录


中文摘要  5-7
英文摘要  7-10
第一章 前言及文献综述  10-19
  1 牛奶中的免疫球蛋白研究进展  10-14
    1.1 免疫球蛋白的基本结构和功能  10-12
    1.2 血液及乳中的免疫球蛋白种类及含量  12-13
    1.3 乳品加工技术对乳中免疫球蛋白的影响的研究进展  13-14
    1.4 乳中免疫球蛋白含量的影响因素  14
  2 动物多聚免疫球蛋白受体（pIgR）研究概况  14-18
    2.1 多聚免疫球蛋白受体（pIgR）的分子结构  15
    2.2 多聚免疫球蛋白受体（pIgR）的生物学功能  15-17
    2.3 动物多聚免疫球蛋白受体（pIgR）的研究概况  17-18
  3 本研究的意义  18-19
第二章 初乳、常乳和免疫乳中的免疫球蛋白含量的变化规律及其SDS-PAGE 分析  19-32
  1 试验目的及意义  19
  2 材料与方法  19-22
    2.1 抗原缓释剂ARD  19-20
    2.2 试验奶牛饲养管理及样品的收集  20-21
    2.3 乳清和血清中免疫球蛋白的测定  21
    2.4 SDS-PAGE 电泳及相对定量分析  21
    2.5 统计分析  21-22
  3 结果与分析  22-29
    3.1 ARD 埋植后血清和乳清中的免疫球蛋白含量的变化规律  22-23
    3.2 初乳中的免疫球蛋白含量的变化规律及其与免疫乳的比较  23
    3.3 免疫球蛋白的相关性分析  23-26
    3.4 SDS-PAGE 电泳及其相对定量分析  26-29
  4 讨论  29-31
    4.1 ARD 埋植后血清和乳清中的免疫球蛋白含量的变化规律  29
    4.2 初乳中的免疫球蛋白含量的变化规律及其与免疫乳的比较  29
    4.3 免疫球蛋白的相关性分析  29-30
    4.4 SDS-PAGE 电泳及其乳清中主要蛋白的相对定量分析  30-31
  5 结论  31-32
第三章 正常泌乳奶牛其乳中IgA 和IgM 含量的影响因素研究  32-41
  1 试验目的及意义  32
  2 材料与方法  32-33
    2.1 试验奶牛的选择  32
    2.2 样品的采集和体细胞数（SCC）的测定  32
    2.3 夹心ELISA 测定乳中IgA 和IgM 的含量  32
    2.4 数据处理与统计分析  32-33
  3 结果  33-38
    3.1 正常泌乳奶牛乳中IgA 和IgM 的含量和分布  33-34
    3.2 奶牛胎次对乳中IgA 和IgM 含量的影响  34
    3.3 奶牛泌乳阶段对乳中IgA 和IgM 含量的影响  34-35
    3.4 奶牛日产奶量对乳中IgA 和IgM 含量的影响  35
    3.5 体细胞数评分（SCS）对乳中IgA 和IgM 含量的影响  35-36
    3.6 对各影响因素进行多元回归分析和通径分析  36-38
  4 讨论  38-40
    4.1 胎次对乳中IgA 和IgM 浓度的影响  38-39
    4.2 泌乳阶段对乳中IgA 和IgM 浓度的影响  39
    4.3 产奶量对乳中IgA 和IgM 浓度的影响  39
    4.4 SCS 对乳中IgA 和IgM 浓度的影响  39-40
    4.5 对各影响因素进行多元回归分析和通径分析  40
  5 结论  40-41
第四章 多聚免疫球蛋白受体基因5’侧翼区的SNP 检测及其与牛奶和血液中的IgA 和IgM 含量的相关性研究  41-48
  1 试验目的及意义  41
  2 材料与方法  41-43
    2.1 样品采集及DNA 的提取  41-42
    2.2 血液和牛奶中IgA 和IgM 含量的ELISA 检测  42
    2.3 主要试剂  42
    2.4 PCR 扩增、纯化后测序发现并确定SNP 位点  42
    2.5 SNP Stream 进行基因分型  42
    2.6 统计分析  42-43
  3 结果与分析  43-46
    3.1 DNA 提取效果及PCR 扩增结果  43
    3.2 PCR 产物测序分析发现SNP 位点  43-44
    3.3 基因型频率、单倍型和单倍型组合频率  44
    3.4 不同SNP 位点、单倍型组合与IgA 和IgM 含量的关联分析  44-46
  4 讨论  46-47
  5 结论  47-48
第五章 小鼠免疫刺激后乳腺中pIgR 基因mRNA 的表达及特异性IgA 含量的变化  48-59
  1 试验目的及意义  48
  2 材料与方法  48-52
    2.1 小鼠及饲养管理  48
    2.2 试验设计  48-49
    2.3 样品采集  49
    2.4 分子生物学主要试剂耗材及仪器设备  49-50
    2.5 检测指标及方法  50-52
    2.6 数据统计分析  52
  3 结果与分析  52-57
    3.1 小鼠乳腺总RNA 的提取效果及其引物的PCR 检测  52-53
    3.2 小鼠乳腺中特异性IgA 含量的变化  53-54
    3.3 小鼠乳腺中pIgR 基因的mRNA 的表达量  54-57
  4 讨论  57-58
    4.1 小鼠血浆和乳中特异性IgA 含量的变化  57-58
    4.2 小鼠乳腺中pIgR 基因的mRNA 表达量的变化  58
  5 结论  58-59
参考文献  59-66
总结论  66-67
本文创新点及后续研究思路  67-68
附录  68-81
  附录一 夹心ELISA 测定IgG/IgA/IgM 含量的方法  68-71
  附录二 SDS-PAGE 电泳及Quantity One 定量分析  71-74
  附录三 奶牛pIgR 基因5’侧翼区的序列及其转录位点的预测  74-77
  附录四 12 重SNPstream 基因分型系统操作手册  77-81
致谢  81-82
攻读学位期间发表的学术论文目录  82-83

相似论文

  1. 红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑中CHS和CHI基因的克隆与表达及其对类黄酮积累的调控机制,S666.4
  2. 乌贼墨—黄芪合剂缓解化疗副作用研究,R285.5
  3. 蛋氨酸羟基类似物异丙酯对奶牛瘤胃发酵和生产性能的影响,S823.8
  4. 烤烟不同香型烟叶质量特点及判别分析,S572
  5. 血管生成调节因子对性成熟前小鼠卵泡及其血管发育的影响,S865.13
  6. 千岛湖岛屿社鼠的巢区和领域研究,Q958.1
  7. β-防御素1基因在小鼠乳腺组织中表达的研究,S852.4
  8. 山药蛋白质分离纯化及抗氧化活性研究,TS255.1
  9. 陆地棉矮化突变体Ari1327的形态、生理和分子标记研究,S562
  10. 烤烟连作对土壤理化特性及烟叶品质的影响,S572
  11. 切花菊品质综合评价体系的构建及性状遗传分析,S682.11
  12. 猪链球菌2型感染小鼠腹腔巨噬细胞基因表达谱差异分析,S858.91
  13. MMP-7和溶菌酶在DSS诱导的Balb/c小鼠溃疡性结肠炎模型发病机制中的作用,S858.91
  14. 三个兽药典方剂的某些药理作用和毒性研究,S859.5
  15. 妊娠标记蛋白PAPPA，PLAC8和PAG mRNA在妊娠奶牛外周血浆中的丰度变化,S858.23
  16. 丙酮酸肌酸对大鼠蛋白质代谢的影响,S865.12
  17. 丹参酮ⅡA及烟酸对肥胖幼鼠心血管功能的影响,R285.5
  18. 蜂毒素对人肝癌HepG-2细胞株裸鼠移植瘤生长的抑制作用及部分机制研究,R735.7
  19. 异丙威影响神经发育主要细胞的迁移分化及突起生长的体外研究,R329
  20. 载脂蛋白E基因敲除及高脂饮食小鼠海马神经元内IP3、IP3R-1和Aβ表达变化的研究,R329
  21. TACI-Ig对MRL/lpr小鼠的治疗作用及对小鼠肾组织JAK1-STAT1信号通路的影响,R363

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜免疫学
© 2012 www.xueweilunwen.com