|
目的:肾间质纤维化(Renal interstitinal fibrosis, RIF)是各种慢性肾损害的共同特征。与肾小球硬化相比,肾间质纤维化的程度与肾功能损害的程度有更高的相关性,故常以间质纤维化作为评价各种肾脏病进展程度的可靠指标。肾间质纤维化的发病机制及因素较多,其中肾间质巨噬细胞的积聚程度与随后相应部位的纤维化程度密切相关,是启动肾间质纤维化病变的重要始动环节。由于间质的巨噬细胞来源于血液中的单核细胞,因此肾间质产生的趋化因子在该过程中发挥重要作用。而骨桥蛋白(osteopontin OPN)是吸引肾间质巨噬细胞最重要的趋化因子,其表达量与间质炎症和纤维化程度密切相关。OPN不但趋化循环中的单核巨噬细胞到肾小管间质,而且直接刺激肾固有细胞如肾小管上皮细胞,启动或扩大炎症反应,而炎症反应可导致肾小管变性损伤,继而肾间质成纤维细胞活化、肾小管萎缩消失。研究发现在肾小管最初受损时,OPN还可促进肾小管上皮细胞再生和重建,帮助其功能的恢复,但随着病情的发展,病变逐渐严重,这种作用失代偿。由此可推断通过局部阻断OPN因子,抑制单核巨噬细胞在肾间质的聚集与增殖,可达到减轻炎症反应,减轻肾小管损伤、抑制纤维化的目的。CD44是OPN的主要配体,已有的研究表明, CD44在炎症过程中发挥重要作用。阿魏酸钠(sodium ferulate,SF)是阿魏酸的合成钠盐,普遍存在于当归、川芎等常用植物药中,水溶性好,已证实SF为一种非肽类内皮素受体拮抗剂,可清除自由基,防治脂质过氧化损伤;拮抗内皮素引起的血管收缩、升压、血管平滑肌细胞增殖,减轻血管内皮损伤、增加一氧化氮(NO)合成、松驰血管平滑肌等特征,可以延缓肾间质纤维化,发挥保护肾功能的作用。目前尚未检索到阿魏酸钠在UUO模型中对于OPN及CD44调节作用,本实验选用经典的UUO模型来进行小管间质纤维化发病机制及干预的实验研究,通过病理及免疫组化的方法观测肾脏中OPN及CD44的表达情况,并观察经阿魏酸钠干预后,OPN、CD44及单核巨噬细胞抗原阳性(ED-1+)细胞表达的改变情况,以阐明OPN参与了肾间质纤维化的发生发展及阿魏酸钠发挥肾脏保护作用机理之一是通过下调OPN和CD44的表达。方法:选择清洁级健康雄性SD大鼠54只,体重(210±10)克,随机分为三组:假手术组(A组n=18),输尿管结扎组(B组n=18),阿魏酸钠治疗组(C组n=18)。将各组大鼠以水合氯醛(0.1ml/kg)腹腔注射麻醉后,行左侧耻骨上切口,沿左肾下极寻找到左侧输尿管,在中上1/3处用4号线上下结扎两处,然后从中剪断输尿管,以防逆行性感染,A组除不结扎和剪断输尿管外,其他手术过程同前。术后各组大鼠均正常饮食。A组和B组大鼠用生理盐水2ml灌胃,1次/日;C组大鼠以阿魏酸钠混悬液110mg/kg/d灌胃,1次/日。三组均于术前一天开始灌胃至术后第3、7、14d每组大鼠各取6只处死,快速取出左肾,按冠状位纵形切开,取肾组织的1/2置于10%福尔马林固定液固定48小时,然后行石蜡包埋,制成5μm切片,分别用于光镜、苏木苏伊红染色(HE染色)、马松染色(Masson染色)观察肾脏病理改变,采用免疫组织化学染色测定OPN、CD44的表达及肾间质单核巨噬细胞数的变化,结果应用图像分析系统进行半定量分析。实验结果均以均数±标准差(x±s)表示,各组间比较采用单因素方差分析,相关分析采用直线相关分析,应用SPSS 11.0统计分析软件对实验数据进行统计学处理,P<0.05为有统计学意义。结果:光镜下观察,HE及Masson染色A组未见异常,B组及C组各时相点大鼠肾脏肾小球无明显变化。HE染色B组术后3天肾小管扩张不明显,间质中少量单核细胞与淋巴细胞浸润,肾间质宽度增加;B组7天可见肾小管扩张明显,上皮细胞变性、水肿、甚至坏死,肾间质大量炎症细胞浸润,间质宽度明显增加,偶见萎缩肾小管;B组14天上述病变加重,可见弥漫的肾小管基底膜增厚皱缩,小管基底膜不同程度断裂,皮质及外髓萎缩的肾小管较多,间质中大量淋巴单核细胞浸润,纤维化较明显。Masson染色可见B组术后3天肾小管扩张,肾间质宽度增加,胶原纤维增加,染色加深;此后,病变逐渐加重。C组与B组平行相比肾小管间质病变程度明显减轻,肾间质相对面积明显减少(P<0.05)。三组间比较均有统计学差异(P<0.05)。免疫组织化学结果显示:①OPN在A组肾组织的亨利氏襻升支粗段、远曲小管、集合管均有少量持续表达,而在肾小球内基本无表达。B组大鼠梗阻侧肾小管-间质中OPN表达较A组明显增加(P<0.05)且表达随小管损伤范围的增加及肾间质纤维化的加重呈明显升高趋势。OPN主要分布在肾小管上皮细胞胞浆及肾小管上皮刷状缘,部分间质细胞亦有表达。术后3天,B组大鼠肾组织表达量较A组有增加,且随着梗阻时间延长升高程度更加明显,至第14天表达最强。C组大鼠在术后各时间点肾小管-间质OPN表达均明显低于B组,但仍高于A组(P<0.05)。②CD44在肾小管上皮细胞表达。A组在整个过程中肾小管细胞只有低度表达。B组肾小管CD44表达第3d时开始上升,第14d升至高峰。C组肾组织各时间点CD44表达量较B组明显减轻,有统计学差异(P<0.05)。③肾间质巨噬细胞的浸润:A组各时期偶可见到巨噬细胞的浸润。B组术后第3天可见少量巨噬细胞浸润,第7天可见多量巨噬细胞浸润,第14天最多,均高于A组(P<0.05)。C组与A组同时期相比巨噬细胞均升高,有统计学差异(P<0.05)。C组与B组同时相相比巨噬细胞数有明显减少,二者有统计学差异(P<0.05)。相关分析:本研究显示,肾小管CD44和OPN的阳性细胞数与小管间质内ED-1浸润的细胞数有明显的相关关系,呈正相关。结论:随单侧输尿管结扎大鼠病情的进展,肾小管间质OPN表达增多,可能在肾间质纤维化中起重要作用。OPN可能通过介导巨噬细胞浸润参与肾间质纤维化,OPN可成为治疗肾间质纤维化的新靶点。内皮素受体拮抗剂阿魏酸钠能够明显减轻肾间质纤维化,其分子机制可能是通过下调OPN的表达,从而发挥其在单侧输尿管结扎大鼠模型中延缓和抑制肾间质纤维化发展的保护作用。
|