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氧化亚铁硫杆菌及嗜酸硫化芽孢杆菌半胱氨酸脱硫酶的分子及功能鉴定

作　者: 刘倩
导　师: 周洪波；陈新华
学　校: 中南大学
专　业: 生物工程
关键词: 半胱氨酸脱硫酶(IscS) 半胱氨酸脱硫酶(SufS) 克隆 表达 免疫共沉淀
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


氧化亚铁硫杆菌(Acidothiobacillus ferrooxidans)在浸矿中具有重要地位,它能氧化亚铁、硫和还原态硫化物,而且氧化亚铁硫杆菌也是浸矿细菌研究的模式菌株。关于氧化亚铁硫杆菌铁硫的氧化的研究都已经比较成熟。在实验室前期工作中发现半胱氨酸脱硫酶(cysteine desulfurase IscS)在硫为唯一能源时,该基因表达上调。半胱氨酸脱硫酶(cysteine desulfurase)是一个以5-磷酸吡哆醛为辅基的二聚体酶,该酶可以催化L-型半胱氨酸转变为L-型丙氨酸生成的硫烷通过形成半胱氨酸的过硫化物,从而保护半胱氨酸残基。为研究该蛋白在硫氧化过程中的作用,利用大肠杆菌E. coliBL21(DE3)作为替代宿主,将含半胱氨酸脱硫酶基因的质粒pET-His-IscS,转入E. coli BL21中使其过表达,发现无论是在固体培养基还是液体培养基中pET-His-IscS/BL21菌株的生长速度都比pET-His/BL21菌株的生长速度快。由此可以看出半胱氨酸脱硫酶能够促进大肠杆菌的生长。将pET-His-IscS/BL21菌株和pET-His/BL21菌株分别接种至含硫代硫酸钠(Na2S2O3)的培养基中,发现在加有2.5%的硫代硫酸钠的LB培养基中,pET-His-IscS/BL21菌株能够正常的生长,而对照菌株却不能生长。可以看出该基因在硫的代谢中是有一定的作用的。我们推测在硫的氧化过程中,首先要打开稳定的S8环成线性的无机硫,才能进一步的氧化,而该基因编码的蛋白在催化半胱氨酸脱去硫形成的带有巯基的半胱氨酸残基可以进行亲核攻击硫环从而打开硫环进行下一步氧化。进一步通过免疫共沉淀筛选到与IscS相互作用的蛋白,经质谱鉴定该蛋白为Short-chain dehydrogenases/reductases (SDR),进一步采用GST-pull down验证了AF3菌IscS与SDR之间确实存在有相互作用。然而随着矿产资源需求量的增加,生物冶金技术对菌的生长温度要求越来越高,因此随之发展起来的中等嗜热菌慢慢占为主导地位。因此本研究对嗜酸硫化芽孢杆菌(TPY)的半胱氨酸脱硫酶(cysteine desulfurase SufS)也采用了同样的研究方法。研究结果发现该酶在大肠杆菌(E. coli)体内过表达后无论是在LB固体培养基还是液体培养基同样也可以促进该菌的生长。且通过western在蛋白分子水平上验证了该蛋白的表达量随着细菌生长的加快而急剧增加。将纯化复性后的SufS蛋白加入LB培养基中也可以促进大肠杆菌的生长。由此可以看出该酶确实是可以促进大肠杆菌生长。在加有3%硫代硫酸钠的LB培养基中,重组菌也是可以正常生长,但是对照菌株却不能生长。这说明该基因在硫的代谢中也是有一定的作用的。且在硫的代谢中的作用机理与IscS蛋白的作用机理相似。在体外通过亚甲基蓝比色法测定了SufS的活性。证明纯化得到的该蛋白在体外是有活性的。也通过免疫共沉淀探讨了在体内与SufS相互作用的蛋白。目前质谱结果还没出来。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
目录  8-11
第一章 绪论  11-22
  1.1 生物冶金的研究进展及浸矿微生物种类  11
  1.2 半胱氨酸脱硫酶的研究进展及分类  11-13
  1.3 半胱氨酸脱硫酶的反应机理及结构  13-15
  1.4 半胱氨酸脱硫酶的功能  15-20
    1.4.1 铁硫簇的组装  15-18
    1.4.2 硫醇的合成  18
    1.4.3 生物素和硫辛酸的合成  18-19
    1.4.4 铁代谢(suf基因簇)  19-20
  1.5 蛋白质相互作用技术  20
  1.6 本文的研究的目的意义及研究内容  20-21
    1.6.1 本文研究的目的及意义  20-21
    1.6.2 本文研究的内容  21
  1.7 本论文课题资助情况  21-22
第二章 材料与方法  22-39
  2.1 实验材料  22-28
    2.1.1 样品  22
    2.1.2 菌株  22
    2.1.3 载体  22
    2.1.4 试剂盒  22
    2.1.5 工具酶  22
    2.1.6 主要仪器  22-23
    2.1.7 引物合成  23
    2.1.8 构建质粒列表  23
    2.1.9 抗体列表  23-25
    2.1.10 培养基及主要溶液  25-28
  2.2 基本方法  28-39
    2.2.1 细菌基因组DNA的提取  28
    2.2.2 PCR反应系统包括  28-29
    2.2.3 菌落PCR  29
    2.2.4 从琼脂糖凝胶上回收DNA片段  29
    2.2.5 连接反应  29-30
    2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备  30
    2.2.7 转化  30
    2.2.8 重组质粒的构建  30-32
    2.2.9 原核表达重组子的构建  32
    2.2.10 融合蛋白的表达及纯化  32-34
    2.2.11 变性蛋白的透析复性  34-35
    2.2.12 多克隆抗体的制备方法  35
    2.2.13 Western blot  35-36
    2.2.14 生长曲线的测定  36
    2.2.15 免疫共沉淀  36
    2.2.16 GST-pull down  36-37
    2.2.17 酶活的测定  37-39
第三章 氧化亚铁硫杆菌半胱氨酸脱硫酶的克隆表达和功能鉴定  39-54
  3.1 结果与分析  39-52
    3.1.1 半胱氨酸脱硫酶(cysteine desulfurase IscS)的分析及克隆  39-42
    3.1.2 cysteine desulfurase IscS原核表达载体的构建  42-43
    3.1.3 cysteine desulfurase IscS促进细菌生长试验  43-46
    3.1.4 半胱氨酸脱硫酶(cysteine desulfurase IscS)在硫代谢中的作用  46-47
    3.1.5 半胱氨酸脱硫酶(cysteine desulfurase IscS)的蛋白相互作用  47-52
  3.2 小结与讨论  52-54
第四章 嗜酸硫化芽孢杆菌半胱氨酸脱硫酶的克隆表达和功能鉴定  54-69
  4.1 结果与分析  54-67
    4.1.1 半胱氨酸脱硫酶(cysteine desulfurase SufS)的分析及克隆  54-57
    4.1.2 cysteine desulfurase SufS原核表达载体的构建  57-59
    4.1.3 cysteine desulfurase SufS促进细菌生长试验  59-63
    4.1.4 cysteine desulfurase SufS酶活的测定  63-65
    4.1.5 半胱氨酸脱硫酶(cysteine desulfurase SufS)在硫代谢中的作用  65-66
    4.1.6 半胱氨酸脱硫酶(cysteine desulfurase SufS)的蛋白相互作用  66-67
  4.2 小结与讨论  67-69
第五章 全文总结与展望  69-70
参考文献  70-78
致谢  78-79
硕士期间研究成果  79

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 酶工程
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