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家蚕BmeIF3s5基因的克隆、表达及亚细胞定位研究

作　者: 左威
导　师: 张耀洲
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 家蚕 真核翻译起始因子3亚基5 免疫印迹法 亚细胞定位
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


真核生物翻译起始因子(eIFs)在蛋白合成中起关键作用,在已经鉴定的13个因子中elF3(由8个或更多的亚基组成)是分子量最大的一个并在翻译起始过程中起着核心作用。eIF3s5是eIF3的其中一个亚基并介导了eIF3大多数功能的实现。我们通过RT-PCR的方法从家蚕蛹中扩增到家蚕eIF3s5基因的完整的ORF序列,并将其命名为BmeIF3s5 (Bombyx mori eIF3s5), GenBank登录号为DQ443287,该基因序列长为834 bp,编码278个氨基酸残基,预测分子量为29.60kD。同源性比较表明该基因编码蛋白质的氨基酸序列在无脊椎动物中具有较高的保守性。将BmeIF3s5基因片段克隆到表达载体pET-28a(+)相应的酶切位点上,得到重组质粒pET-28a(+)-BmeIF3s5,经PCR、酶切鉴定以及测序分析证实重组正确。将该重组子转化E. coli Rosetta,工程菌经IPTG诱导表达后,裂解菌体作SDS-PAGE分析,与阴性对照相比在33.28 kD左右的位置有一条特异性蛋白条带。重组蛋白以包涵体的形式存在,故超声裂解菌体,分离包涵体并洗涤、溶解,12000rpm离心所得的上清采用亲和层析的方法纯化融合蛋白。经FPLC反相柱层析进一步纯化后,再进行质谱分析,结果显示该融合蛋白的分子量为34.03 kD,与理论值33.28 kD(融合标签3.81 kD,BmeIF3s5 29.60 kD)相符。将纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测该抗体血清的效价可达到1:25600以上。用Western blotting实验分析BmeIF3s5蛋白在家蚕不同时期和不同组织中的表达情况,结果表明BmeIF3s5在所检测家蚕的各发育时期和各组织中均有不同程度的表达,其中丝腺、卵、蛾的表达量较高。通过亚细胞定位发现该蛋白主要存在于细胞质中。本研究为进一步探讨BmeIF3s5蛋白在家蚕生长、发育过程中的生物学功能奠定了基础。

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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