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超声微泡介导VHL基因转染干预肾癌发生与发展的实验研究及临床意义

作　者: 宫云翔
导　师: 宋希双
学　校: 大连医科大学
专　业: 外科学
关键词: VHL基因 786-0 增殖与凋亡超声微泡基因转染
分类号: R737.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：VHL基因得名于VHL病(Von Hippel-Lindau’s disease),是一种典型的抑癌基因,具有抑制细胞生长、抑制血管生成、调节细胞周期等作用,在多种途径上抑制肿瘤的发生与发展。肾癌的发病涉及多种基因,其中在遗传性和散发性的患者中都能发现VHL基因的异常,因此VHL基因被认为是肾细胞癌的主要癌基因。我们的前期研究结果表明肾癌中广泛存在着VHL基因突变和超甲基化等情况,且与临床分期、组织学类型、淋巴结转移相关。我们认为VHL基因失活与肾癌的发生发展密切相关,更待深入探讨。基因疗法在癌症治疗上有广阔的应用前景。基因疗法的研究中,基因传输方法是成功进行基因治疗的一个关键步骤,虽然传统的病毒基因载体具有较高的基因转染效率,但该类方法的安全性和长期疗效受到质疑,限制了其临床应用。近几年,非病毒基因载体引起了研究者的关注并得到了广泛研究。超声靶向微泡破坏技术(Ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)是一种相对安全、高效的基因转染新方法。超声波辐照超声微泡破裂后对细胞产生的空化效应可以使细胞膜的通透性可逆性增加,促进基因向细胞内转染。具有安全,高效,靶向性强的特点。本实验为了进一步研究VHL基因在调节肾细胞癌的增殖、凋亡中所起的作用,以及超声微泡基因转染技术的安全性和转染效率。我们使用肾癌细胞系作为体外研究对象,应用超声微泡基因转染技术将VHL基因转染肾癌细胞系(786-0),测定VHL基因在肾癌细胞系中的表达情况,同时测定细胞的增殖和凋亡情况,阐明VHL基因在肾癌中的抑制作用。之后分别应用超声微泡和脂质体基因转染技术将pEGFP-VHL进行转染,免疫荧光法测定转染效率；分别应用超声微泡和脂质体基因转染技术将空载体进行转染,MTT法评价细胞生长活性。证明超声微泡基因转染技术是一种安全有效的基因传输新策略。为肾癌基因治疗提供新的靶点和策略。方法：1.构建真核表达载体pcDNA3.1-VHL,应用超声微泡基因转染技术转染肾癌细胞系(786-0),利用RT-PCR方法检测转染pcDNA3.1-VHL载体、转染pcDNA3.1空载体及未处理的786-0细胞中VHL的表达,另通过MTT法检测转染后细胞增殖能力的变化,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。2.构建pEGFP-VHL融合基因表达载体,分别通过超声微泡基因转染技术和脂质体基因转染技术将pEGFP-VHL转染786-0细胞,免疫荧光法测定转染效率；分别应用超声微泡和脂质体基因转染技术将空载体转染786-0细胞,MTT法评价各组细胞生长活性。结果：1.与未处理的和转染空载体的786-0细胞比较,转染pcDNA3.1-VHL的786-0细胞中VHL基因的mRNA表达水平均明显增加。未处理与转染空载体的786-0细胞中VHL的mRNA表达水平比较差异无显著性。转染pcDNA3.1-VHL的786-0细胞生长抑制率明显高于未处理的和转染空载体的786-0细胞。流式仪检测细胞凋亡率,与未处理的和转染空载体的786-0细胞比较,转染pcDNA3.1VHL的786-0细胞凋亡率明显增加。2.pEGFP-VHL基因转染786-0细胞48h后的转染效率：对照组0,脂质体组(35.55±2.77)%,超声微泡组(18.27±2.83)%；两种转染方法对细胞活力的影响没有显著性差异。结论：1.将VHL基因转染786-0细胞后,与各阴性对照组相比,786-0细胞能够表达VHL基因,并且VHL基因的mRNA表达水平大幅提高。通过MTT和流式细胞仪检测,786-0细胞的生长抑制率明显增加,786-0细胞的凋亡率明显增加。证明VHL基因表达能够明显抑制肾癌细胞系786-0的增殖能力,并促进其凋亡。VHL基因是肾癌基因治疗的潜在靶点。2.与对照组相比,超声微泡组转染率在一定范围有所提高,与脂质体介导体外转染相比,两种转染方法对细胞活力的影响没有显著性差异,超声辐照超声微泡的方法转染效率仍然较低,其具体的转染方法以及转染条件还有待于进一步优化,超声辐照超声微泡促进基因转染还存在较多问题,需要继续探索。

全文目录

一、摘要  5-11
  (一) 中文摘要  5-8
  (二) 英文摘要  8-11
二、文献综述  11-20
  (一) 综述  11-17
  (二) 参考文献  17-20
三、正文  20-37
  (一) 前言  20-21
  (二) 材料与方法  21-27
  (三) 结果  27-30
  (四) 讨论  30-34
  (五) 结论  34-35
  (六) 参考文献  35-37
四、附录  37-38
五、致谢  38-39

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