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癫痫对海马内Munc-18蛋白分布和表达的影响

作　者: 张彦平
导　师: 朱粹青
学　校: 复旦大学
专　业: 神经生物学
关键词: Munc-18蛋白癫痫(Epilepsy) 海人藻酸(Kainic acid) 原代培养神经元谷氨酸(Glutamate acid) 基因转染细胞核
分类号: R742.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

Munc-18蛋白在神经系统中参与了突触囊泡释放各步骤的调节。2000年首次报道,在一例‘’Rasmussen’s Encephalitis(RE)"癫痫性疾病患者的血清和脑脊液中检测到了抗Munc-18蛋白的抗体。而08年Nature Genetic报道了在一名患有“婴儿型癫痫性脑病伴抑制-爆发波型脑电图(EIEE)”的女性染色体中检测到munc-18基因错义突变。提示Munc-18蛋白在神经系统有重要的功能,其功能异常将导致神经系统疾病的发生。以往的研究主要集中在胞浆中Munc-18蛋白调节神经元递质释放的机制,05年有一篇文献报道,在神经元胞核内检测到Munc-18蛋白,并且该蛋白可与DNA片段紧密结合。上述结果提示Munc-18蛋白在细胞核内可能参与基因表达的调控。但是目前还没有关于神经系统疾病与Munc-18蛋白在细胞核分布变化关系的研究。本实验在上述研究结果的基础上,以海人藻酸(KA)诱导癫痫动物模型和经兴奋性氨基酸-谷氨酸作用的原代培养神经元为观察对象,研究了神经元兴奋与Munc-18细胞核分布的关系。现将试验结果概述如下：1、对大鼠海马进行的免疫组织化学和免疫电镜观察显示Munc-18不仅在神经元细胞浆中分布,在神经元细胞核中也有分布。用差速离心的方法分离海马内神经元的细胞核和胶质细胞的细胞核。对这些不同组分的细胞核进行的Western blot分析显示,Munc-18主要在神经元细胞核中分布。2、采用腹腔注射KA诱导小鼠癫痫发作模型和海马内注射KA诱导大鼠癫痫发作模型。对模型动物冰冻脑片进行免疫组化观察显示,癫痫发作后,Munc-18蛋白在海马CA3区和齿状回区域分布减少,神经元胞核中Munc-18蛋白分布减少明显；Western blot对分离的细胞核进行检测,结果显示：与生理盐水组动物相比,癫痫发作后海马组织总蛋白中Munc-18表达量没有改变,神经元细胞核组分中Munc-18蛋白分布量显著减少,而去核组分蛋白中Munc-18蛋白表达量增加；另外,实验观察到癫痫发作可诱导海马内SNAP-25表达增加。3、用50μM谷氨酸(Glu)处理原代培养的神经元3h,免疫荧光检测观察到谷氨酸可以使Munc-18蛋白在神经元突起分布增加、胞核内分布减少；Western blot检测显示：谷氨酸对神经元总蛋白中Munc-18蛋白表达量没有影响,使神经元核蛋白中Munc-18蛋白表达量减少,去核组分中Munc-18蛋白表达量增加；同时观察到谷氨酸处理使神经元内SNAP-25和Tra-2β表达增加。4、构建pDsRed-N 1-munc-18-FL, pDsRed-N 1-munc-18-N两种真核细胞表达质粒,并在转染SH-SY5Y细胞后进行了观察,结果显示结合红色荧光蛋白的全长大鼠Munc-18蛋白,以及缺失Munc-18蛋白两个潜在入核序列中一个片断的Munc-18蛋白,都可以进入细胞核内。提示了这两个潜在入核序列可能都参与了Munc-18蛋白入核机制。综上所述,神经元在兴奋性刺激后可导致细胞核内的分布减少,同时伴有SNAP-25和Tra-2β表达增加,Munc-18有两个具有活性的入核序列。该研究提示Munc-18的细胞核内分布受神经元的兴奋状态调节,神经元兴奋诱导的SNAP-25和Tra-2β表达增加是否直接与Munc-18细胞核内分布减少有关尚需进一步验证。

全文目录

缩略语表  4-5
中文摘要  5-7
Abstract  7-10
前言  10-12
第一部分: 癫痫对脑内和神经元内Munc-18蛋白分布和表达的影响  12-38
  材料和方法  12-20
  统计分析  20-21
  实验结果  21-38
第二部分: 谷氨酸对原代神经元内Munc-18蛋白分布和表达的影响以及Munc-18蛋白出入核机制初探  38-58
  材料与方法  38-45
  统计分析  45-46
  实验结果  46-58
全文小结  58-59
讨论  59-66
参考文献  66-70
综述  70-83
  参考文献  79-83
致谢  83-84

癫痫对海马内Munc-18蛋白分布和表达的影响

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