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树突状细胞疫苗治疗转移性大肠癌客观疗效预后标志的研究

作　者: 黄晓辉
导　师: 万涛
学　校: 第二军医大学
专　业: 免疫学
关键词: DC 免疫治疗微卫星热休克蛋白70 CD45RO TIL
分类号: R735.34
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

大肠癌是常见的恶性肿瘤之一,世界卫生组织(WHO)最新的有关全球癌症状况的数据显示,大肠癌的死亡率位居实体瘤肿瘤第三。最新的统计数据表明,我国发病的上升速度远远超过国际水平,达到4%以上。由于大肠癌发病隐匿,初次就诊的患者近30%发现转移,目前对于转移性大肠癌的患者,化疗仍然是这部分患者的主要治疗手段。但是大肠癌患者对化疗药物不敏感性及耐药性问题,及化疗还可导致的一系列毒副反应,使得探究新的治疗手段,成为肿瘤治疗的一个新热点。树突状细胞(Dendritic cell, DC)疫苗在肿瘤免疫治疗的临床研究中已取得了突破性的进展。当今以DC为基础诱导的特异性抗肿瘤免疫疗法已成为肿瘤生物治疗领域新的研究热点。2004年我们研究所获得了我国SFDA正式批准的第一项树突状细胞治疗性疫苗(抗原致敏的人树突状细胞,Antigen-pulsed dendritic cells, APDC)的Ⅱ期临床批文,并开展了DC为基础的序贯性免疫化疗治疗转移性大肠癌的Ⅱ期临床研究。在已经完成的142例转移性大肠癌的病例研究中,试验组采用奥沙利铂(OXA)+5-氟尿嘧啶(5-Fu)联合DC免疫治疗的有效率为45.07%(CR+PR),而对照组采用奥沙利铂(OXA)+5-氟尿嘧啶(5-Fu)治疗的有效率仅为25.35%,两组差异显著(P=0.043),试验组的有效率显著高于对照组,提示了DC为基础的序贯性免疫化疗疗法在转移性大肠癌的治疗效果好于单纯化疗的治疗方式。肿瘤是在体内外各种因素的作用下由一系列基因连续突变从而导致细胞正常生长状态失去控制所致。因而每一个肿瘤患者,即使是同一种肿瘤,其体内外各种致病因素都不同,每一个肿瘤患者都有其独特的生物学特征,即肿瘤的异质性。肿瘤的异质性就需要对不同患者“区别对待”,因此治疗的个性化已成为目前肿瘤治疗学的一个新的特征,探索对治疗性敏感患者的共同特征,对这些敏感患者采用特殊的治疗方式,对进一步提高大肠癌病人的临床疗效,具有重大意义。由于大肠癌患者肿瘤存在的异质性,那么是否有一些大肠癌患者,他们会对DC免疫治疗方式更为敏感呢?对这类敏感患者采用DC免疫治疗的治疗方式,对进一步提高大肠癌病人的临床疗效,具有重大的意义。在我们的临床研究中均采用肿瘤患者自身的肿瘤抗原负载DC,利用体外获得的肿瘤抗原致敏的树突状细胞(APDC)回输患者体内,促进其体内的CD8+杀伤性T细胞(CTL),对肿瘤细胞进行杀伤作用,达到治疗肿瘤的效果。那么,肿瘤本身的抗原性会不会影响DC免疫治疗的疗效?肿瘤本身免疫原性越高,会不会促进DC免疫治疗的效果?是否存在一类免疫原性高的患者其对DC免疫治疗更为敏感,更有利于接受DC免疫治疗,从而提高其临床治疗效果呢?肿瘤的发生、发展和转移不仅和其本身的免疫原性有关,还与其周围生长的微环境有着密切的联系。肿瘤的微环境即指在肿瘤周围生长的非肿瘤细胞及各种分子,包括血管,神经,基质细胞,免疫相关细胞及免疫相关的调节分子等等。大量的临床研究提示肿瘤微环境中的许多免疫相关细胞可以作为癌症的预后因素。那么肿瘤微环境中的这些免疫相关的调节因素对DC免疫治疗是否有影响呢?是否这些因素的有利调节作用,更易于激发免疫应答,从而影响最终的疗效呢?本课题旨在对已取得的临床结果的基础上进行回顾性的分析,进一步探索肿瘤本身的免疫原性及肿瘤生存的微环境中各种免疫相关的因素对与DC免疫治疗的影响。分析寻找对DC免疫治疗性敏感的患者的免疫学特征,探讨其作为DC免疫治疗的敏感性标志的可能性。为以DC为基础的免疫治疗晚期大肠癌的Ⅲ期临床的开展提供科学的数据。本研究共分三个部分进行第一部分大肠癌微卫星分型和DC免疫治疗转移性大肠癌客观疗效的分析微卫星不稳定性大肠癌是大肠癌的一种类型(Microsatellite Instability, MSI),研究显示高频率微卫星不稳定性的患者(MSI-H),肿瘤本身可能具备更强的免疫原性,该部分患者尽管细胞分化较差但预后往往较好。我们通过对大肠癌患者的微卫星分型,分析其与树突状细胞疫苗治疗转移性大肠癌客观疗效的关系。我们收集了部分APDC与化疗联合治疗转移性大肠癌的Ⅱ期临床研究中试验组(DC联合化疗)及对照组(单纯化疗)的患者的肿瘤及正常组织的石蜡切片,共101例,其中试验组60例,对照组41例,并分别提取了肿瘤和正常组织的DNA,参照国立癌症研究所Boland等的标准,分别合成了五个微卫星位点是BAT26,BAT25,D5S346,D2S123,D17S250的荧光引物,并进行了荧光PCR反应,取扩增结束后的PCR产物,在ABI3730测序仪毛细管电泳,运用GENE SCAN软件对正常组织和肿瘤组织的荧光PCR产物进行自动分析原始的样品处理数据,测定五个微卫星位点的迁移片段的大小,并最终完成对101例临床患者的MSI分型工作。结果显示,101例临床病人中19例患者D17S250发生了突变,7例患者D2S123发生了突变,21例患者D5S346发生了突变,4例患者BAT26发生了突变,5例患者BAT25发生了突变；在试验组共60例其中MSS有37例,MSI-L有13例,MSI-H有10例；对照组中共41例其中MSS有22例,MSI-L有15例,MSI-H有4例；MSS这类患者在对照组中的有效率(CR+PR)为43.24%,对照组中为22.73%,两者比较未显现统计学差异(P=0.161)；MSI-L这类患者在试验组中的有效率为38.46%,对照组中为40.00%,两者比较未显现统计学差异(P=1.000)；MSI-H这类患者在试验组中的有效率为80.00%,对照组中为50.00%,两者比较未显现统计学差异(P=0.052)。MSS这类患者在试验组中的总好转率(CR+PR+MR)为51.35%,对照组中为40.91%,两者比较未显现统计学差异(P=0.591)；MSI-L这类患者在试验组中的总好转率为38.46%,对照组中为66.67%,两者比较未显现统计学差异(P=0.255)；MSI-H这类患者在试验组中的总好转率为100.00%,对照组中为50.00%,虽然两者比较未显现统计学差异(P=0.066)。MSS在试验组中有效率为43.24%,MSI-H在试验组中的有效率为80.00%,虽然两者比较未显现统计学差异(P=0.072),但也提示了MSI-H这类患者经过DC免疫治疗后其疗效可能比MSS更好。第二部分大肠癌原发灶浸润免疫细胞和DC免疫治疗转移性大肠癌客观疗效分析肿瘤的发生、发展和转移不仅与其本身的肿瘤细胞有关,还与其周围生长的微环境有着密切的联系,这部分我们主要研究原发灶肿瘤浸润的免疫细胞相关的特性与DC免疫治疗疗效的关系。我们选取101例APDC与化疗联合治疗转移性大肠癌的Ⅱ期临床研究中试验组及对照组的患者的肿瘤组织的石蜡切片,选取CD8, CD45RO,IL-10,IL-17四种免疫组化抗体。免疫组化的方法对101例患者的肿瘤组织的石蜡切片进行染色,用Leica DM2000显微镜对染色后的石蜡切片进行观察,并应用Qwin软件对浸润于肿瘤组织中三个不同的区域肿瘤细胞巢(Tumor Nests),肿瘤侵袭边缘(Invasive Margin, IM),肿瘤中心(Center of the Tumor,CT),分别进行计数,每个区域任意选意取五个视野,结果判定为五个视野的阳性细胞数总和除以5,最终确认浸润于不同区域的不同阳性细胞的数值。结果表明：101例病人石蜡切片中IL-10与IL-17抗体阳性表达较少,表达阳性分别只有8例和24例,而CD45RO, CD8阳性细胞在肿瘤的浸润的三个区域(肿瘤中心,癌巢,侵袭边缘)都有不同程度的表达。初步设定CD45RO阳性细胞浸润肿瘤中心,侵袭边缘,肿瘤细胞巢的截断值分别是10,25,2；CD8阳性细胞在浸润肿瘤中心,侵袭边缘,肿瘤细胞巢的截断值分别是50,50,2,设定截断值以上的为高密度浸润,截断值以下的为低密度浸润。结果显示：CD45RO阳性细胞高密度浸润于肿瘤中心(CT)在试验组的有效率为47.50%,对照组中为21.74%,统计学分析后,出现显著性差异(P=0.044),CD45RO阳性细胞低密度浸润于肿瘤中心(CT)在试验组的有效率为50.00%,对照组中为44.44%,统计学分析后,未出现显著性差异(P=0.735)；在试验组中CD45RO阳性细胞高密度浸润于肿瘤中心(CT)有效率为47.50%,低密度浸润于肿瘤中心(CT)的有效率为50.00%,统计学分析后,未出现显著性差异(P=0.856)；在对照组中CD45RO阳性细胞高密度浸润于肿瘤中心(CT)有效率为21.74%,低密度浸润于肿瘤中心(CT)的有效率为44.44%,统计学分析后,未出现显著性差异(P=0.126)。以上结果提示了CD45RO阳性细胞高密度浸润于肿瘤中心(CT)患者在经过DC免疫治疗联合化疗后其临床疗效显著高于单纯化疗,其原因可能是CD45RO阳性细胞高密度浸润患者对化疗的不敏感性,而联合DC免疫治疗可以提高化疗的疗效。CD45RO阳性细胞高密度浸润于肿瘤细胞巢(Tumor Nests)在试验组的有效率为52.63%,对照组中为21.74%,统计学分析后,出现显著性差异(P=0.031);CD45RO阳性细胞低密度浸润于Tumor Nests在试验组的有效率为40.91%,对照组中为44.44%,统计学分析后,未出现显著性差异(P=1.000),提示CD45RO阳性细胞高密度浸润于肿瘤细胞巢(Tumor Nests)的患者在经过DC免疫治疗联合化疗后其临床疗效显著高于单纯化疗,其原因可能是CD45RO阳性细胞高密度浸润患者对化疗的不敏感性,而联合DC免疫治疗可以提高化疗的疗效。CD45RO阳性细胞高密度浸润于肿瘤侵袭边缘(IM)在试验组的有效率为41.40%,对照组中为36.80%,统计学分析后,未出现显著性差异(P=0.753); CD45RO阳性细胞低密度浸润于IM在试验组的有效率为54.80%,对照组中为27.30%,统计学分析后,出现显著性差异(P=0.047)；在试验组中CD45RO阳性细胞高密度浸润于IM有效率为41.40%,低密度浸润于IM的有效率为54.80%,统计学分析后,未出现显著性差异(P=0.361),在对照组中CD45RO阳性细胞高密度浸润于IM的有效率为36,80%,低密度浸润于IM的有效率为27.30%,统计学分析后,未出现显著性差异(P=0.737),提示CD45RO阳性细胞低密度浸润于肿瘤侵袭边缘(IM)的患者经DC免疫治疗联合化疗方式治疗后,其有效率好于单纯化疗。CD8阳性细胞无论浸润于肿瘤细胞巢(Tumor Nests),肿瘤中心(CT),肿瘤侵袭边缘(IM),将其各区域浸润的程度差异与其DC免疫治疗的疗效进行分析,均未出现统计学差异。第三部分大肠癌细胞的免疫学特性和DC免疫治疗转移性大肠癌客观疗效分析肿瘤的发生、发展和转移不仅与其周围生长的微环境有着密切的联系,也与其本身的各种性质有关。这部分我们主要研究大肠癌细胞的免疫学相关特性和DC免疫治疗的疗效分析。我们还是选取101例APDC与化疗联合治疗转移性大肠癌的Ⅱ期临床研究中试验组及对照组的患者的肿瘤组织的石蜡切片,选取Hsp70这种免疫组化抗体。免疫组化的方法对101例患者的肿瘤组织的石蜡切片进行染色,用LeicaDM2000显微镜对染色后的石蜡切片进行观察,每个区域任意选意取五个视野,结果判定为五个视野的阳性细胞数总和除以5,最终确认肿瘤细胞表达Hsp70的阳性比例。设定表达Hsp70肿瘤细胞占总体肿瘤细胞比例为25%作为截断值,高于截断值为肿瘤细胞高表达Hsp70,低于截断值为肿瘤细胞低表达Hsp70。结果表明：肿瘤细胞高表达Hsp70在试验组的中的有效率为62.16%,对照组中为36.00%,统计学分析后,出现显著性差异(P=0.045),肿瘤细胞低表达Hsp70在试验组的有效率为26.09%,对照组中为25.00%,统计学分析后,未出现显著性差异(P=0.940)；在试验组中肿瘤细胞高表达Hsp70的有效率为62.16%,肿瘤细胞低表达Hsp70的有效率为26.09%,统计学分析后,出现显著性差异(P=0.007),在对照组中肿瘤细胞高表达Hsp70的有效率为36.00%,肿瘤细胞低表达Hsp70的有效率为25.00%,统计学分析后,未出现显著性差异(P=0.466),以上结果提示肿瘤细胞高表达Hsp70的患者在经过DC免疫治疗联合化疗后其临床疗效显著高于单纯化疗,其原因可能是肿瘤细胞高表达Hsp70的患者因其Hsp70的免疫佐剂效应和危险信号因素,促使其在DC免疫治疗联合化疗的治疗方式下,提高了化疗的疗效。结论：1.CD45RO阳性细胞高密度浸润于肿瘤中心(CT)和肿瘤细胞巢的患者,经过DC免疫治疗联合化疗后其临床疗效显著高于单纯化疗,提示CD45RO阳性细胞高密度浸润于肿瘤中心(CT)和肿瘤细胞巢可作为DC免疫治疗重要的预后因素。2.肿瘤细胞高表达Hsp70的患者在经过DC免疫治疗联合化疗后其临床疗效显著高于单纯化疗,提示肿瘤细胞高表达Hsp70可以作为DC免疫治疗重要的预后因素。3.CD45RO阳性细胞低密度浸润于肿瘤侵袭边缘(IM)的患者经DC免疫治疗联合化疗方式治疗后,其有效率好于单纯化疗。4.将MSI不稳定的这类患者与DC免疫治疗的疗效总好转率(CR+PR+MR)进行分析后发现,MSI-H这类特殊的大肠癌患者经DC免疫治疗联合化疗后,总好转率高于单纯化疗,提示其可能经DC的免疫治疗联合化疗的治疗方式有助于改善其临床疗效,但还有待大量临床研究进一步论证。

全文目录

中文摘要  5-10
英文摘要  10-14
缩略词表  14-15
前言  15-17
第一部分大肠癌微卫星分型和DC 免疫治疗转移性大肠癌客观疗效的分析  17-33
  材料与方法  17-20
  结果  20-31
  讨论  31-33
第二部分大肠癌原发灶浸润免疫细胞和DC免疫治疗转移性大肠癌客观疗效分析  33-63
  材料与方法  34-35
  结果  35-59
  讨论  59-63
第三部分大肠癌细胞的免疫学特性和DC免疫治疗转移性大肠癌客观疗效分析  63-72
  材料与方法  63-64
  结果  64-69
  讨论  69-72
总结  72-73
参考文献  73-76
综述  76-86
致谢  86

树突状细胞疫苗治疗转移性大肠癌客观疗效预后标志的研究

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