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聚醚类抗生素基因资源的挖掘

作　者: 王后根
导　师: 白林泉；邓子新
学　校: 上海交通大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 环氧化酶 CODEHOP PaBaLiS 基因簇盐霉素拉沙里菌素
分类号: R91
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

1.聚醚类抗生素基因资源的挖掘:聚醚类抗生素是由链霉菌产生的一类重要的聚酮类化合物,被广泛的用于治疗鸡球虫病(Coccidiosis)和作为牲畜饲料添加剂。它们的生物合成是经过一个聚酮链的多烯前体,然后通过一系列后修饰反应合成的。在这些后修饰反应中,最关键的一步反应是将多烯前体氧化成环氧键中间体,这一步反应是由环氧化酶催化的,这个环氧化酶在聚醚类抗生素生物合成基因簇中非常保守。为了快速定位聚醚类抗生素生物合成基因簇,我们利用这个保守的环氧化酶基因家族,通过序列比对,寻找出它们之间的共性,找出了一些关键的保守氨基酸,根据这些保守的氨基酸设计几套简并引物,从中找出了一对基于PaBaLiS原理的效果最好的引物作为通用引物,从另外四个基因簇尚未被报道的聚醚类抗生素产生菌中成功筛选到了它们的环氧化酶基因,这些新筛选到的环氧化酶基因片段与已知的环氧化酶同源性高达50%~90%,另外我们还从正反向引物比例角度优化了简并引物筛选基因簇的方法。在比较了CODEHOP和PaBaLiS原理的基础上,我们通过实验对CODEHOP原理作了适当完善。2.盐霉素基因簇的克隆:盐霉素(Salinomycin)是在生产上已经被广泛应用的抗生素。根据文献报道的部分盐霉素基因簇序列,我们成功筛选到了包括这段序列本身在内的长度为38000个碱基对的序列,但是经对序列的分析发现,这部分序列可能并不是负责合成盐霉素的。于是我们用在上面提到的依据已知的环氧化酶序列并按照PaBaLiS原理设计的引物,重新从盐霉素产生菌中筛选到另外一个可能是负责盐霉素合成的基因簇,并证实这个新的基因簇与原来那个并没有重叠,进一步的实验还在进行之中。3.拉沙里菌素基因簇的克隆:拉沙里菌素(Lasalocid)是一个结构比较特殊的聚醚类抗生素,对其基因簇的克隆和研究可以进一步完善聚醚类抗生素的生物合成原理,在尝试很多筛选方法都失败以后,我们依据结构域酰基载体蛋白(AT)和酮基还原酶(KR)之间长度的保守型,在AT和KR上设计引物,通过控制PCR时间,成功的筛选到了拉沙里菌素生物合成基因簇,并通过接合转移实验证实了我们筛选到的基因簇就是负责合成拉沙里菌素的。

全文目录

中文摘要  5-6
英文摘要  6-10
符号说明  10-13
第一章文献综述  13-37
  1.1 聚醚类抗生素的研究进展  13-16
    1.1.1 聚醚类抗生素应用价值  13-16
  1.2 聚醚类抗生素环氧化酶催化功能的研究  16-19
  1.3 聚醚类抗生素环氧键水解酶催化功能的研究  19-20
  1.4 聚醚类抗生素的生物合成基因簇  20-28
    1.4.1 莫能霉素(monensin)生物合成基因簇  20-23
    1.4.2 南昌霉素（nanchangmycin）生物合成基因簇  23-25
    1.4.3 尼日利亚菌素(nigericin)生物合成基因簇  25-26
    1.4.4 拉沙里菌素(lasalocid)生物合成基因簇  26-27
    1.4.5 盐霉素(salinomycin)生物合成基因簇  27-28
  1.5 抗生素基因簇资源挖掘方法  28-37
第二章材料与方法  37-51
  2.1 实验材料  37-41
    2.1.1 菌株及质粒  37-39
    2.1.2 培养基与化学试剂  39-41
  2.2 实验方法  41-51
    2.2.1 链霉菌培养及菌种保藏[66]  41
    2.2.2 链霉菌DNA 的大量提取  41-42
    2.2.3 链霉菌质粒DNA 的小量提取  42
    2.2.4 大肠杆菌质粒质粒DNA 的提取  42-43
    2.2.5 链霉菌总DNA 的少量快速提取  43
    2.2.6 DNA 片段的回收  43
    2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备  43-44
    2.2.8 质粒对大肠杆菌感受态细胞的转化  44
    2.2.9 高压电击法大肠杆菌感受态细胞的制备  44
    2.2.10 高压电击法转化大肠杆菌  44-45
    2.2.11 链霉菌DNA 文库构建  45-48
    2.2.12 DNA 文库的筛选  48
    2.2.13 两亲本介导的质粒DNA 的跨属接合转移及验证  48-49
    2.2.14 拉沙里菌素的生物学活性测定  49
    2.2.15 拉沙里菌素以及衍生物的快速提取  49-50
    2.2.16 利用HPLC-MS 对拉沙里菌素以及衍生物进行检测分析  50
    2.2.17 生物信息学分析  50-51
第三章聚醚类抗生素资源挖掘方法的研究  51-76
  3.1 前言  51-55
  3.2 结果与讨论  55-75
    3.2.1 简并引物的设计  55-56
    3.2.2 引物条件的优化及对环氧化酶基因的扩增  56-61
    3.2.3 对已知环氧化酶基因和环氧化酶类似基因序列的分析  61
    3.2.4 环氧化酶系统进化树及与结构对应关系  61-66
    3.2.5 区分两类环氧化酶基因的引物优化  66-69
    3.2.6 对未知菌株库的筛选  69-72
    3.2.7 对BL580△产生菌的中断实验  72-75
  3.3 总结  75-76
第四章盐霉素生物合成基因簇的克隆研究  76-90
  4.1 前言  76
  4.2 结果与分析  76-89
    4.2.1 盐霉素基因簇的筛选  76-78
    4.2.2 盐霉素基因簇阳性Cosmid 37F1 的序列分析  78-84
    4.2.3 另一个可能的盐霉素基因簇  84-88
    4.2.4 大片段缺失实验  88-89
  4.3 总结  89-90
第五章拉沙里菌素生物合成基因簇的克隆研究  90-96
  5.1 前言  90-91
  5.2 结果与分析  91-95
    5.2.1 拉沙里菌素基因簇的筛选  91-93
    5.2.2 单交换验证拉沙里菌素基因簇  93-95
  5.3 总结  95-96
第六章总结与展望  96-98
  6.1 本研究工作总结与主要创新点  96
  6.2 聚醚类抗生素下一阶段研究工作展望  96-98
参考文献  98-103
致谢  103-104
攻读硕士学位期间发表学术论文  104-107
上海交通大学硕士学位论文答辩决议书  107

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