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酒酒球菌不同菌株16S rDNA PCR-RFLP分析

作　者: 余东亮
导　师: 刘树文
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 葡萄与葡萄酒学
关键词: 苹果酸-乳酸发酵 酒酒球菌 特异引物 RFLP分析
分类号: TS261.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


研究表明,能够适应葡萄酒环境、较专一地进行苹果酸-乳酸发酵并对酒质有增益作用的细菌主要是酒球菌属的细菌。它是目前启动葡萄酒苹果酸-乳酸发酵最重要、应用最广泛的葡萄酒乳酸菌。酒球菌属目前只包括一个种,即酒酒球菌(Oenococcus oeni),葡萄酒发达国家都通过对酒酒球菌的分离、筛选,得到了优良菌株,并作为商业发酵剂应用于葡萄酒的工业生产中。我国幅员辽阔,种质资源丰富,恰逢葡萄酒产业蓬勃发展,因此对优良乳酸菌菌株尤其酒酒球菌的筛选、鉴定及不同菌株的分析显得尤为重要。本实验选用一对特异引物对筛选自宁夏产区的25株葡萄酒乳酸菌进行了鉴定;之后运用酶切方法,对实验室保存的23株优良酒酒球菌菌株的16S rDNA扩增条带进行酶切,分析23株菌的系统分类地位,并对不同酶切图谱类型菌株进行发酵特性试验,对不同谱型菌株的发酵能力进行了考察。通过试验,得到以下结果:1、通过对筛选自宁夏酿酒产区的25株葡萄酒乳酸菌进行部分生理、生化试验,与葡萄酒乳酸菌鉴定表进行比对,25株菌均符合鉴定表中关于酒酒球菌的描述。2、通过对两种基因组DNA提取方法的对比,发现采用溶菌酶法提取出的基因组,普遍存在RNA污染问题(A260/A280>2.0);由于分子扩增及酶切分析对提取基因组的纯度提出了较高的要求,通过方法二,细胞裂解后,分别对蛋白质、RNA等影响基因组纯度因素进行酶消化处理,保证了提取基因组的纯度。对选取样品进行电泳检测发现,均达到扩增要求。3、对特异引物扩增体系中的Taq酶、dNTP、引物、Mg2+、模板DNA等因素进行了优化,建立了特异引物扩增体系:在50μL的反应总体积中,2.5UTaq酶、200μmol/L dNTP、0.2μmol/L上/下游引物、2.0mmol/L Mg2+、DNA模板40ng。运用建立的扩增体系,对特异引物的特异性进行验证后,对筛选自宁夏酿酒产区的25株葡萄酒乳酸菌进行扩增鉴定,均扩增出一条唯一的、清晰的、大约995bp的特异条带,因此,通过鉴定,25株菌均为酒酒球菌。4、对实验室保存的23株优良酒酒球菌菌株的扩增条带进行酶切分析,得到5个不同的谱型,通过聚类分析,在0.63水平上可以把23株菌区分为2个大类。并随机选取不同谱型的菌株进行发酵特性试验,研究发现,4个带型的SD-2a、6个带型的31-DH菌株显示较强的耐酒精能力;3个带型的SD-2g、4个带型的SD-2a及5个带型的SX-1a菌株耐酸能力较为稳定;2个带型的HB-1a、4个带型的SD-2a及3个带型的SD-2g菌株对较高浓度的SO2具有明显的耐受能力。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
第一章 文献综述  12-32
  1.1 葡萄酒苹果酸-乳酸菌研究  12-16
    1.1.1 葡萄酒乳酸菌的种类  12-13
    1.1.2 发酵过程中葡萄酒乳酸菌种类的变化  13-14
    1.1.3 酒球菌属的建立  14-15
    1.1.4 酒酒球菌的特征  15-16
  1.2 葡萄酒中的苹果酸-乳酸发酵  16-21
    1.2.1 苹果酸-乳酸发酵的作用  16-19
    1.2.2 葡萄酒乳酸菌的物质代谢  19-21
  1.3 影响葡萄酒乳酸菌生存与生长的因素  21-25
    1.3.1 葡萄酒的理化特性与组成  22-24
    1.3.2 酿造工艺的影响  24
    1.3.3 微生物间的相互关系  24-25
  1.4 葡萄酒乳酸菌的分离  25
    1.4.1 苹果酸-乳酸菌的分离方法  25
    1.4.2 酒酒球菌的分离  25
  1.5 乳酸菌研究中常用的分子生物学方法  25-28
    1.5.1 16S rRNA 序列分析  25-26
    1.5.2 随机扩增多态DNA 技术  26
    1.5.3 限制性片段长度多态性分析  26-27
    1.5.4 扩增片段长度多态性  27
    1.5.5 全细胞可溶性蛋白电泳  27
    1.5.6 核酸杂交  27-28
  1.6 酒酒球菌分子研究进展  28-30
    1.6.1 基于种水平的研究  28-29
    1.6.2 基于菌株水平的研究  29-30
  1.7 试验目的及意义  30-32
第二章 材料与方法  32-38
  2.1 试验材料  32-34
    2.1.1 试验菌株  32
    2.1.2 培养基  32-33
    2.1.3 主要试剂及来源  33
    2.1.4 主要仪器和设备  33-34
  2.2 方法  34-38
    2.2.1 菌种的活化、分离  34
    2.2.2 乳酸菌的初步鉴定  34
    2.2.3 生长曲线绘制  34-35
    2.2.4 酒酒球菌基因组DNA 提取  35
    2.2.5 酒酒球菌16S rRNA 特异引物  35-36
    2.2.6 特异引物反应体系的建立和优化  36
    2.2.7 特异引物的特异性验证和未知菌株的鉴定  36
    2.2.8 PCR 产物限制性内切酶分析  36-37
    2.2.9 不同谱型菌株对pH、SO_2、酒精单因子抗性实验  37-38
第三章 结果与分析  38-52
  3.1 菌株的形态学初步鉴定  38-39
    3.1.1 培养特征  38
    3.1.2 其他形态学特征  38-39
  3.2 菌株生长曲线的绘制  39
  3.3 基因组DNA 的提取及纯度检测分析  39-42
  3.4 PCR 反应体系影响因素的优化  42-44
    3.4.1 Taq 酶的优化  42
    3.4.2 三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）浓度的影响  42-43
    3.4.3 不同Mg~(2+)浓度对PCR 扩增结果的影响  43
    3.4.4 引物浓度对酒酒球菌PCR 反应体系的影响  43
    3.4.5 DNA 模板量的影响  43-44
  3.5 特异引物的验证及菌株的鉴定  44-46
  3.6 PCR 产物酶切结果  46-47
    3.6.1 数据分析  47
  3.7 不同谱型菌株对pH、SO_2、酒精单因子抗性实验  47-52
    3.7.1 不同谱型菌株对酒精的抗性  48-49
    3.7.2 不同谱型菌株对pH 的抗性  49-50
    3.7.3 不同谱型菌株对SO_2 的抗性  50-52
第四章 讨论  52-55
  4.1 株菌的分离、培养  52
  4.2 基因组提取方法的选择  52
  4.3 PCR 扩增因素的优化  52-53
  4.4 特异引物的鉴定  53
  4.5 酶切及酿酒适应性分析  53-55
第五章 结论  55-56
参考文献  56-62
致谢  62-63
作者简介  63

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 酿造工业 > 酿酒工业 > 酿酒微生物
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