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大鼠神经细胞蛋白质复合物组学和多肽组学研究

作　者: 张海
导　师: 王贤纯
学　校: 湖南师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 背根神经节复合物 BN-PAGE SDS-PAGE 串联质谱海马肽组学
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)细胞是一种初级感觉神经元,能传导触觉、痛觉、温觉等神经冲动。它们沟通脊髓与机体内外环境的联系,不仅传输和调节机体的各种感觉,而且还具有接受和传递机体各种伤害性感受的功能,因而在神经病理性疼痛的发生与维持中起着重要的作用。开展DRG细胞膜蛋白的研究具有重要意义,将为探讨神经系统疾病的发生机制、疾病的诊断和新药开发将提供重要的理论基础。由于大鼠DRG神经组织体积较小而质膜蛋白质又大多具有低丰度和强疏水性的特点,所以在样品的采集、溶解和蛋白质鉴定等方面给DRG细胞质膜蛋白质组学研究带来了更大的挑战。大多数细胞的生物学功能都是由蛋白复合体而非单一蛋白质来完成的,因此,蛋白质复合物的研究已成为蛋白质组学中最重要研究内容之一。本研究用含温和去垢剂的缓冲液提取大鼠DRG细胞细胞浆和膜组分中的蛋白质复合物后,采用BN-PAGE结合SDS-PAGE的方法对蛋白质复合物进行电泳分离,再用CapLC-MS/MS进行分析。一共鉴定了非冗余蛋白质460个,包括若干细胞浆和膜组分中的蛋白质复合物的亚基。多肽组就是指生物体器官、组织、细胞和体液中全部内源性多肽组份。多肽组学是研究多肽的结构、功能、变化规律等及其相互关系的学科。多肽组学和蛋白质组学都是作为基因组学的补充,多肽组学填补了代谢组学与蛋白质组学之间的“间隙”。常规的蛋白质组研究策略并不适合多肽组的研究,因为常规的蛋白质组研究策略不能有效鉴定低分子量区域的多肽。影响多肽组分析的一个主要因素就是大脑及大多数其它组织中的多肽水平低于蛋白质降解产生的多肽水平。此外,动物体内的蛋白酶会在动物死后短时间内降解蛋白质。已有研究结果表明,常规微波炉能有效的阻止动物死后蛋白质的降解。海马是大脑边缘系统结构中最重要的组织之一,在学习和记忆中起着重要作用。为了研究海马多肽的种类、结构和作用,我们就海马的多组学展开了研究。首先,将大鼠的头颅置于家用微波炉并在10s内将海马组织的温度升至80℃,从而使海马组织中的各种酶失活,然后用乙酸和尿素分别进行提取内源性多肽。提取液分别用分子截留量为10 kD超滤管进行超滤,RP-HPLC脱盐后加入10 mM DTT,再用TOF-Q MS进行鉴定。得到的数据文件运用MASCOT软件分析。库搜寻时的主要参数为：酶：无；固定修饰：无；可变修饰：N末端乙酰化,C末端酰胺化,甲硫氨酸氧化,磷酸化和脱氨基化。实验结果表明,从微波辐射加热处理的海马组织提取物中共鉴定到非冗余多肽82个,而未经微波加热处理时只鉴定到13个。在鉴定的82个多肽中,66个多肽从乙酸提取物中鉴定到,26个从尿素提取物中鉴定到。进一步的分析显示,部分鉴定的多肽为已知多肽,而另一些为本研究新鉴定的神经多肽。

全文目录

中文摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
第一章大鼠背根神经节细胞蛋白质复合物组学研究  10-32
  1.1 前言  10-14
  1.2 实验材料和实验设备  14-15
  1.3 实验步骤  15-23
    1.3.1 急性分离DRG  15
    1.3.2 DRG复合物样品制备  15-16
    1.3.3 蛋白质复合物的分离  16-18
    1.3.4 蛋白质复合物亚基的分离  18-19
    1.3.5 蛋白质复合物的鉴定和分析  19-23
  1.4 实验结果  23-30
    1.4.1 大鼠DRG细胞蛋白质复合物的分离  23-26
    1.4.2 鉴定的蛋白质性质分析  26-27
    1.4.3 大鼠DRG细胞蛋白质复合物分析  27-30
  1.5 进一步研究设想  30-32
第二章大鼠海马细胞多肽组学研究  32-51
  2.1 前言  32-36
  2.2 实验材料和实验设备  36-37
  2.3 实验方法  37-39
    2.3.1 海马组织样品制备  37
    2.3.2 多肽的分离  37-38
    2.3.3 多肽的鉴定和分析  38-39
  2.4 实验结果  39-50
    2.4.1 多肽的分离和鉴定  39-48
    2.4.2 部分鉴定的多肽性质分析  48-50
  2.5 进一步研究设想  50-51
参考文献  51-57
缩写表  57-59
附表1 大鼠DRG细胞蛋白质复合物中鉴定的蛋白质  59-71
附表2 大鼠海马组织细胞中鉴定到的部分多肽二级图谱  71-91
发表文章目录  91-92
致谢  92-93

大鼠神经细胞蛋白质复合物组学和多肽组学研究

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