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西宁地区番茄内生芽孢杆菌定殖规律及促生效应的研究

作　者: 刘涛
导　师: 刁治民
学　校: 青海师范大学
专　业: 植物学
关键词: 番茄内生芽孢杆菌拮抗发酵定殖促生作用
分类号: S641.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

在西宁不同地区采集健康的番茄植株,用稀释分离法共分离出24株菌株,通过回接验证试验得出,菌株TG-1等20株菌株为内生菌。番茄的根、茎、叶和种子中都存在着内生菌。用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),大肠杆菌(Escherichia coli)作为指示菌,将分离到的内生菌进行抑菌能力的测定,筛选出了三株具有较强拮抗作用的菌株,TG-1,TG-2,S-2。通过观察内生菌在牛肉膏蛋白胨培养基上的特征和生理生化特性,初步鉴定出菌株TG-1为坚强芽孢杆菌,菌株TG-2为枯草芽孢杆菌,菌株S-2为多粘芽孢杆菌。通过单因素试验,测定了三株菌株的生长曲线以及所需要的最佳温度、pH值、转速、装液量、接种量,得出三株菌株的生长曲线大致相同,0～12h,处于生长的延滞期;在12～22 h,是对数生长期;在22～48h,处于生长的稳定期;从48h开始,开始进入生长的衰亡期。当灭菌后的pH值为6.7时,菌株TG-1和菌株S-2生长最好,当灭菌后的pH值为7.3时,菌株TG-2生长最好;菌株TG-1和S-2的最适生长温度为28℃,菌株TG-2的最适生长温度为30℃,三株菌株的最佳接种量为1%,最佳转速为150r/min;菌株TG-1和S-2的装液量为50ml/200ml时,生长量最大,菌株TG-2的装液量为50ml/250ml时,生长量最大。通过单因素试验和正交设计对三菌株的发酵培养基进行优化,得出菌株TG-1优化培养基配方为:玉米粉20g,麸皮1.5g,磷酸氢二钾0.6g,酵母膏1.5g,水1000ml。菌株TG-2优化培养基配方为:玉米粉20g,蛋白胨2g,磷酸氢二钾0.2g,硫酸镁0.2g,酵母膏1.5g,水1000ml。菌株S-2优化培养基配方为:红糖20g,牛肉膏1.5g,磷酸氢二钾+硫酸镁(1:1)0.6g,酵母膏1.5g,水1000ml。以抗利福平和硫酸链霉素双抗性为标记,用不同的接种方法测定菌株TG-1和TG-2在不同品种的番茄中的定殖动态,除了喷雾法之外其余的接种方法均可以回收到标记菌,并且灌根法和浸种法接种效果较好。用灌根法接种TG-1~R菌株和TG-2~R菌株至不同品种的番茄植株和辣椒、白菜等植株后,发现能在番茄体内和其他作物中较好的定殖并传导,其消长规律为先增加后降低。这表明这两株菌株对番茄品种没有选择性,且有广泛的寄主植物。用菌株TG-1和TG-2的发酵液原液、10倍稀释液、100倍稀释液、1000倍稀释液浸泡番茄种子和处理幼苗后,发酵液原液对两个品种的番茄的萌发、干重、根茎长、出苗率、鲜重均有明显的抑制作用,而稀释液对其有不同程度的促进作用。用发酵液稀释液、上清液、菌体分别浸泡番茄种子后,对番茄幼苗均有一定的促生作用。对于菌株TG-1,菌体的促生效果最好,而对于菌株TG-2,上清液(胞外分泌物)的促生作用最强。灌根法、浸种法、注射法三种接种方式对番茄的株高、鲜重及干重都表现出一定的促进作用;均可以提高番茄的单果重和单株产量;可以提高番茄中糖的含量、番茄红素的含量、酸度比,明显改善番茄的品质。对白菜、辣椒和小麦三种作物的生长较对照均有一定的促进作用,说明该菌可以广泛的应用于农业生产中。促生机制研究表明:菌株TG-1和TG-2能够进入植物体内定殖并传导,该菌在植物体内定殖量的多少与其促生作用呈正相关;起促生作用的并不单单是菌体或其外分泌物,而是这两者共同起作用的结果;并且可通过提高植物体内叶绿素的含量,提高植物叶片的光合速率、蒸腾速率等,从而促进植物的光合作用而达到促进其生长;能降低植株体内丙二醛的含量,从而保护细胞膜促进植物生长,促进根的生长。以上多种因素综合作用,是菌株TG-1和TG-2促进植株生长的主要机制。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
第一章文献综述  10-27
  1.1 植物内生菌的概念和种类  10-14
    1.1.1 植物内生菌的概念和发展历史  10-11
    1.1.2 植物内生细菌的分离  11-12
    1.1.3 植物内生菌的种类及数量  12-14
  1.2 植物内生菌定殖的研究  14-19
    1.2.1 植物内生细菌的来源  14-15
    1.2.2 植物内生菌进入植物体的途径  15
    1.2.3 内生细菌在植物体内的消长动态  15-16
    1.2.4 内生细菌在植物体内的定殖检测  16-18
      1.2.4.1 抗生素抗性标记  16-17
      1.2.4.2 免疫学方法  17
      1.2.4.3 DNA 和RNA 探针技术  17
      1.2.4.4 标记基因法  17-18
    1.2.5 影响定殖的因子  18-19
      1.2.5.1 生物因子  18
      1.2.5.2 非生物因子  18-19
  1.3 植物内生菌生物学作用及其机制的研究  19-24
    1.3.1 对植物病害的防治作用  19-20
    1.3.2 促进植物生长作用  20-21
    1.3.3 内生细菌的固氮作用  21-22
    1.3.4 内生菌作为外源基因载体  22
    1.3.5 内生细菌对植物的不利影响  22-24
      1.3.5.1 内生细菌对植物生长发育的抑制作用  22-23
      1.3.5.2 内生细菌的致病作用  23-24
      1.3.5.3 内生细菌对植物组织培养的影响  24
  1.4 芽孢杆菌的研究进展  24-25
  1.5 番茄及茄科其它植物内生菌研究进展  25-27
第二章番茄内生芽孢杆菌的分离、拮抗菌的筛选与鉴定  27-38
  2.1 试验材料  27
  2.2 试验方法  27-33
    2.2.1 番茄根部、茎部、叶片内生芽孢杆菌的分离、纯化  27-28
    2.2.2 番茄种子内生芽孢杆菌的分离、纯化  28
    2.2.3 回接验证试验  28
    2.2.4 拮抗菌株的筛选  28
    2.2.5 拮抗菌株的鉴定  28-33
      2.2.5.1 显微形态观察  28-29
      2.2.5.2 群体形态观察  29
      2.2.5.3 生理生化鉴定  29-33
  2.3 结果与分析  33-38
    2.3.1 番茄内生菌的分离、纯化结果  33-34
    2.3.2 回接验证试验结果  34
    2.3.3 拮抗菌株的筛选结果  34-35
    2.3.4 拮抗菌株的鉴定  35-38
      2.3.4.1 拮抗菌株的形态学特征  35-36
      2.3.4.2 拮抗菌株的生理生化鉴定  36-38
第三章番茄内生芽孢杆菌发酵营养的研究  38-55
  3.1 试验材料  38
  3.2 试验方法  38-42
    3.2.1 发酵条件的优化  38-40
      3.2.1.1 菌量-吸光值标准曲线的建立  38-39
      3.2.1.2 培养液pH 值对细菌生长影响的测定  39
      3.2.1.3 接种量对细菌生长影响的测定  39
      3.2.1.4 温度对细菌生长影响的测定  39
      3.2.1.5 转速对细菌生长影响的测定  39-40
      3.2.1.6 装液量对细菌生长影响的测定  40
      3.2.1.7 菌株生长曲线及代时的测定  40
    3.2.2 发酵培养基的优化  40-42
      3.2.2.1 细菌种液的制备  40
      3.2.2.2 不同碳源的利用  40-41
      3.2.2.3 不同氮源的利用  41
      3.2.2.4 不同金属离子的利用  41
      3.2.2.5 发酵最佳碳氮比及最佳培养基配方的筛选  41-42
  3.3 结果与分析  42-55
    3.3.1 发酵条件的研究  42-47
      3.3.1.1 菌量-吸光值标准曲线  42-43
      3.3.1.2 培养液pH 值对细菌生长的影响  43-44
      3.3.1.3 接种量对细菌生长的影响  44-45
      3.3.1.4 温度对细菌生长的影响  45
      3.3.1.5 转速对细菌生长的影响  45-46
      3.3.1.6 装液量对细菌生长的影响  46-47
      3.3.1.7 三株菌株的生长曲线  47
    3.3.2 发酵营养的测定  47-55
      3.3.2.1 菌株发酵最佳碳源的筛选  47-48
      3.3.2.2 菌株发酵最佳氮源的筛选  48-49
      3.3.2.3 菌株发酵金属离子的筛选  49-50
      3.3.2.4 菌株发酵最佳碳氮比及其最佳培养基配方的筛选  50-55
第四章番茄内生芽孢杆菌定殖和消长规律的研究  55-64
  4.1 试验材料  55
  4.2 试验方法  55-58
    4.2.1 双抗标记菌株(利福平,硫酸链霉素)的诱变和筛选  55-56
    4.2.2 标记菌株的形态观察和生理生化测定  56
    4.2.3 标记菌株入侵番茄途径的测定  56-57
    4.2.4 标记菌在番茄组织内及根围土壤中的消长动态测定  57
    4.2.5 标记菌株在不同品种的番茄中的定殖性测定  57-58
    4.2.6 标记菌株在不同作物中的定殖及消长动态  58
  4.3 结果与分析  58-64
    4.3.1 双抗标记菌株(利福平,硫酸链霉素)的诱变和筛选结果  58
    4.3.2 标记菌株的形态观察和生理生化测定结果  58-59
    4.3.3 标记菌株入侵番茄的途径  59-60
    4.3.4 标记菌在番茄组织内及根围土壤中的消长动态  60-62
    4.3.5 标记菌株在不同品种的番茄中的定殖性  62
    4.3.6 标记菌株在不同作物中的定殖及消长动态  62-64
第五章番茄内生芽孢杆菌促生效应的研究  64-77
  5.1 试验材料  64
  5.2 实验方法  64-67
    5.2.1 不同浓度浸种对番茄种子萌芽及根芽生长的影响  64-65
    5.2.2 不同浓度浸种对对番茄幼苗促生作用测定  65
    5.2.3 菌株菌体和胞外分泌物对番茄幼苗促生作用测定  65
    5.2.4 不同接种方式对番茄促生作用的测定  65-66
    5.2.5 菌株TG-1 不同接种方式对番茄产量及品质的影响  66
    5.2.6 菌株TG-1 对其他作物促生作用的研究  66
    5.2.7 菌株 TG-1 促生机制的研究  66-67
  5.3 结果与分析  67-77
    5.3.1 不同浓度浸种对番茄种子萌发及根芽生长的影响  67-68
    5.3.2 不同浓度浸种对番茄幼苗生长的影响  68-70
    5.3.3 菌株菌体和胞外分泌物对番茄幼苗促生作用结果  70-71
    5.3.4 不同接种方式对番茄的促生作用  71-72
    5.3.5 菌株TG-1 不同接种方式对番茄产量及品质的影响  72-74
    5.3.6 菌株TG-1 对其他作物的促生作用  74
    5.3.7 菌株TG-1 的促生机制  74-77
第六章结果与讨论  77-81
  6.1 番茄内生芽胞杆菌的分离、拮抗菌的筛选与鉴定  77
  6.2 番茄内生芽孢杆菌生理学特性的研究  77-79
  6.3 番茄内生芽孢杆菌定殖和消长规律的研究  79
  6.4 番茄内生芽孢杆菌促生效应的研究  79-80
  6.5 存在的问题及后续工作  80-81
参考文献  81-88
图版  88-92
致谢  92-93
个人简历  93-94
在校期间发表的学术论文  94

西宁地区番茄内生芽孢杆菌定殖规律及促生效应的研究

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