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新生小鼠心肌干细胞与心肌细胞共培养诱导分化研究

作　者: 欧念文
导　师: 陆东风
学　校: 广州医学院
专　业: 心血管内科学
关键词: 心肌干细胞共培养诱导
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 144次
引　用: 1次
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内容摘要

目的:1.了解心肌条件培养液有无诱导心肌干细胞(Cardiac stem cells,CSCs)向心肌细胞分化的作用。2.CSCs与心肌细胞接触对CSCs分化有何影响。方法:1.将新生1-2天小鼠心脏组织剪成0.5-1mm3碎片,用DPBS洗涤红细胞,轻微消化组织块后,进行贴壁培养11-14天后,用胰酶进行差速消化并采集原代CSCs。2.用免疫磁珠分选原代细胞得到c-Kit+ CSCs。3.流式细胞术分析未分选的原代细胞表面CD45、CD34、Sca-1、c-Kit标志。分选后细胞检测c-Kit标志纯度及细胞周期。4.结合原位免疫荧光检验c-Kit+的纯度。5.分选后的c-Kit+ CSCs分3组进行培养。a.空白对照组,无干预因素,用1%血清培养液培养CSCs 21天。b.条件液组添加心肌细胞条件培养液诱导CSCs 21天。用1%血清培养液培养心肌细胞48小时后得到心肌条件培养液。方法示意图见附图尾页。c.混合培养组分别用PKH26和DAPI标记CSCs后与心肌细胞混合共培养8天,期间均以1%血清培养液培养。PKH26标记的CSCs用于免疫组化鉴定,并与空白组和条件液进行对比; DAPI标记的CSCs,共培养后再进行消化分离并分散传代,改用10%血清培养液,2周内,观察并寻找来源于CSCs,带DAPI标记的单独搏动细胞。6.观察各组CSCs形态变化,当空白组、条件液组和PKH26标记的混合培养组的细胞完成培养后,用原位免疫组化法鉴定肌钙蛋白T(Troponin-T)和间隙连接蛋白43(connexin43),评估CSCs向心肌细胞分化的程度,每组检测一种蛋白需要6个培养样本,其中1个用于阴性对照。7.分析试验数据:原位免疫组化每孔随机抽四周+中央五个200倍视野,计数阳性细胞和阴性细胞后进行χ2检验或秩和检验分析,以P<0.05为差异具有显著性。混合培养组中评估在心肌细胞附近的CSCs。结果:1.原代未分选的细胞主要表达干细胞标志c-Kit和Sca-1,低表达造血干细胞标志CD34和白细胞标志CD45。2.分选后得到纯度较高的c-Kit+ CSCs,流式细胞术分析其纯度约96%,原位免疫荧光检验也支持以上结果。3.分选后的c-Kit+ CSCs中处于S期和G2期的细胞比例约34.6%,说明其染色体复制和细胞分裂较活跃。4.空白组CSCs在低血清条件下增殖活力较差,部分细胞死亡;条件液组中CSCs增殖活力稍好,细胞平均密度是空白组的2倍。空白组和条件液组均未出现自发搏动的细胞。混合培养组中与心肌细胞接触的CSCs形态饱满,并与心肌细胞同步搏动。分离混合培养的细胞,可见少数单独搏动的带DAPI标记的细胞。5.原位免疫组化技术:经过21天后,心肌条件培养液不能有效的诱导CSCs分化成熟至表达心肌细胞特异的Troponin-T和connexin43蛋白,条件液组与空白组比较无显著性差异。而CSCs与心肌细胞接触8天后,能表达上述两种蛋白,与空白组比较有显著性差异。结论1.心肌条件培养液无诱导CSCs向心肌细胞分化的作用。2.与心肌细胞接触能有效地诱导CSCs向心肌分化。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-10
前言  10-13
材料与方法  13-19
结果  19-22
讨论  22-29
结论  29-30
参考文献  30-35
附图  35-40
综述  40-53
致谢  53-54

新生小鼠心肌干细胞与心肌细胞共培养诱导分化研究

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