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大鼠卡氏肺孢子虫DHFR和DHPS基因序列的测定与分析

作　者: 杨霞霞
导　师: 万启惠
学　校: 遵义医学院
专　业: 免疫学
关键词: 卡氏肺孢子虫 DHFR DHPS 基因 PCR-RFLP
分类号: R450
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的分析我国卡氏肺孢子虫遵义分离株的二氢叶酸还原酶(DHFR)和二氢叶酸合成酶(DHPS)基因的序列特性,应用PCR限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术分析DHPS基因的变异。方法(1)用地塞米松磷酸钠注射液腹股沟皮下注射的方法,用SD大鼠建立肺孢子虫肺炎动物模型。(2)实验分组:正常对照组(正常大鼠),阴性对照组(给磺胺药的正常大鼠),阳性对照组(建立Pc模型未给磺胺药的大鼠)和实验组(建立Pc模型并用磺胺药治疗的大鼠)。(3)肺组织印片六亚甲基四胺银染色观察卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii,Pc)包囊,肺组织切片苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察其病理变化。(4)收集大鼠的肺组织,提取DNA,用PCR方法扩增卡氏肺孢子虫的DHFR和DHPS基因,纯化扩增产物后测序。检索基因文库(Gene bank,gb),进行同源性分析。(5)用AccⅠ和HaeⅢ两种酶对DHPS基因的PCR扩增产物进行酶切,并应用PCR-RFLP技术对其进行分析。结果(1)实验组和阳性对照组大鼠全部感染Pc,正常对照组和阴性对照组未发现Pc。(2)实验组和阳性对照组的Pc DHFR和DHPS基因PCR扩增均呈阳性,阴性对照组和正常对照组无扩增。实验组和阳性对照组Pc DHFR有832个碱基,与gb[M26495](Pcf.sp.rat)序列比较,同源性均为99%,与gb[AF322061](Pc f.sp.rat)序列比较,同源性均为100%。实验组大鼠DHPS基因有816个碱基,与gb[U66283](Pc f.sp.muris)序列比较同源性为94%,与gb[U66282](Pc f.sp.hominis)相似性为83%。阳性对照组SD大鼠的卡氏肺孢子虫DHPS基因序列有839个碱基,与gb[U66283]序列比较同源性为95%,与gb[U66282]相似性为84%。(3)通过限制性内切酶AccⅠ和HaeⅢ酶切电泳,应用PCR-RFLP技术分析实验组和阳性对照组大鼠Pc DHPS基因并未发现Ala55/Ser57位点的突变。结论(1)地塞米松磷酸钠皮下注射法是一种建立SD大鼠肺孢子虫肺炎动物模型的良好方法。(2)实验组和阳性对照组Pc DHFR和DHPS基因的PCR扩增均呈阳性,两个基因与Gene bank内相应大鼠源肺孢子的基因序列同源性较高。(3)PCR具有灵敏性好、分辨率高、重复性好、操作简便、快速等优点,适用于肺孢子虫肺炎的分子生物学诊断。(4)进行PCR-RFLP分析后发现我国卡氏肺孢子虫遵义分离株的DHPS基因为野生型。

全文目录

1 大鼠卡氏肺孢子虫 DHFR和DHPS 基因序列的测定与分析  2-52
  1.1 主要英汉缩略词对照表  4-5
  1.2 中文摘要  5-7
  1.3 英文摘要  7-9
  1.4 前言  9-11
  1.5 材料与方法  11-16
  1.6 结果  16-39
  1.7 讨论  39-43
  1.8 结论  43-44
  附图  44-49
  1.9 参考文献  49-52
2 肺孢子虫肺炎的分子生物学研究现状(综述)  52-70
3 致谢  70-71

大鼠卡氏肺孢子虫DHFR和DHPS基因序列的测定与分析

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