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猪高热病细菌性病原的分离鉴定及其生物学特性研究

作　者: 陈申秒
导　师: 魏建忠；李郁
学　校: 安徽农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 副猪嗜血杆菌多杀性巴氏杆菌猪胸膜放线杆菌猪链球菌复合PCR
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

猪“高热病”是由多种病原混合感染引起的综合征,针对安徽地区猪群中广泛流行的多病因“高热病”进行细菌性病原的研究对“高热病”的防治具有重要的现实意义。副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)形态学、生长特性相似,临床感染难以区分,本研究根据HPS、Pm、APP的特异性序列,成功建立了复合PCR方法的快速诊断方法,该方法特异性好,可以检测出HPS、Pm、APP最低量分别为60pg、120pg和50 pg的DNA,极大的提高了三种细菌的鉴定速度和效率,同时将该方法应用于病死猪的病料检测,结果显示该方法可用于HPS、Pm、APP的临床监测。利用常规细菌分离鉴定结合建立的复合PCR方法,从安徽肥东、肥西、淮北、桐城、阜阳、宿州、六安、庐江、宣城、舒城十个地区的具有高热及呼吸系统症状的146头发病或死亡猪中分离细菌67株,分离率为45.89%,其中SS 20株,HPS 12株,Pm 16株,APP 2株,分离率分别为29.85%;17.91%;23.88%;2.98%,初步了解到安徽地区的规模化猪场及散养户中广泛存在的细菌感染情况。对16分离株Pm进行血清型鉴定发现12株为荚膜A型,占总数的75%,表明A型Pm是当前安徽地区Pm的主要流行血清型;利用特异性引物对20株分离的SS进行鉴定发现5株为2型猪链球菌,阳性率25%;对安徽分离的12株HPS进行了PCR-RFLP基因型的鉴定,12株HPS可分成5种不同的基因型;生长特性表明2株APP均为生物Ⅰ型;药敏试验结果表明4种分离菌对14种抗菌素的敏感性不同,但都对氟苯尼考、头孢噻肟、阿莫西林和环丙沙星敏感,这四种药物可用于临床防治。对安徽省HPS分离株转铁蛋白结合蛋白(tbpA)基因进行扩增和序列测定,根据序列同源性建立系统发生树,并与RFLP分型结果进行比较,发现相同基因型的分离株在相同或相近的进化关系上;对分离株HPS进行动物感染试验,相同RFLP型的分离菌致病性一致,表明tbpA是影响HPS致病性的重要因素。总之,本研究针对安徽地区猪“高热病”中细菌性病原分离鉴定、优势血清型及药物敏感性的研究对猪“高热病”的防治具有理论的指导意义;对tbpA与HPS致病性的关系研究,为安徽地区猪“高热病”及细菌性病原的深入研究提供了基础资料。

全文目录

中文摘要  4-5
Abstract  5-8
插图和附表清单  8-10
主要符号列表  10-11
文献综述  11-23
1 引言  23-24
2 材料与方法  24-35
  2.1 材料  24-26
    2.1.1 病料来源  24
    2.1.2 参考菌株  24
    2.1.3 主要培养基  24
    2.1.4 主要试剂与溶液配制  24-25
    2.1.5 细菌微量生化反应管  25
    2.1.6 抗生素药敏试验纸片  25-26
    2.1.7 引物设计  26
    2.1.8 主要仪器  26
  2.2 细菌的分离培养与生化鉴定  26-27
    2.2.1 培养基的制备  26-27
    2.2.2 细菌的分离培养  27
    2.2.3 生化试验鉴定  27
  2.3 HPS、Pm、APP 复合PCR 方法的建立与应用  27-28
    2.3.1 细菌DNA 的提取  27
    2.3.2 病料中细菌DNA 提取  27
    2.3.3 PCR 扩增  27-28
    2.3.4 复合PCR 反应条件优化方案  28
    2.3.5 PCR 产物分析  28
    2.3.6 复合PCR 的特异性测定  28
    2.3.7 复合PCR 的敏感性  28
    2.3.8 复合PCR 的临床应用  28
  2.4 A 型Pm 的鉴定  28-29
    2.4.1 DNA 模板的制备  28-29
    2.4.2 A 型Pm 的PCR 鉴定  29
  2.5 SS2 的PCR 鉴定  29-30
  2.6 分离株HPS 部分生物学特性研究  30-31
    2.6.1 HPS 形态多样性  30
    2.6.2 HPS 卫星现象  30
    2.6.3 HPS 生长曲线的测定  30
    2.6.4 HPS 16srRNA 序列测定与分析  30-31
    2.6.5 HPS 动物感染试验  31
  2.7 副猪嗜血杆菌tbpA RFLP 型与序列分析  31-34
    2.7.1 tbpA 的扩增  31-32
    2.7.2 tbpA-RFLP 型鉴定  32
    2.7.3 tbpA 基因的克隆与分析  32-34
      2.7.3.1 PCR 产物的连接  32-33
      2.7.3.2 E.coli DH5α感受态细胞的制备  33
      2.7.3.3 转化E.coli DH5α感受态细胞  33
      2.7.3.4 重组质粒的提取及鉴定  33-34
      2.7.3.5 重组质粒的PCR 鉴定  34
      2.7.3.6 基因序列测定与分析  34
  2.8 HPS、Pm、APP、SS 药物敏感试验  34-35
3 结果  35-53
  3.1 HPS、Pm、APP、SS 的分离培养与生化鉴定  35-39
    3.1.1 HPS 的分离培养与生化鉴定  35-36
    3.1.2 Pm 的分离培养与生化鉴定  36-37
    3.1.3 APP 的分离培养与生化鉴定  37-38
    3.1.4 链球菌的分离培养与生化鉴定  38-39
  3.2 HPS、Pm、APP 复合PCR 方法的建立与应用  39-42
    3.2.1 HPS、Pm、APP 复合PCR 体系的优化  39-40
    3.2.2 复合PCR 方法的特异性  40-41
    3.2.3 复合PCR 的敏感性  41
    3.2.4 复合PCR 的临床应用  41-42
  3.3 A 型Pm 的PCR 鉴定结果  42
  3.4 SS2 的PCR 鉴定结果  42
  3.5 分离株HPS 部分生物学特性研究  42-47
    3.5.1 HPS 多形态性观察  42-43
    3.5.2 HPS 卫星现象  43
    3.5.3 HPS 生长曲线  43-44
    3.5.4 HPS 分离株16srRNA 序列扩增与测定  44-45
    3.5.5 HPS 动物感染试验  45-47
  3.6 HPS tbpA PCR-RFLP 分型与tbpA 序列分析  47-50
    3.6.1 分离菌tbpA 的扩增  47
    3.6.2 tbp A 的RFLP 分型  47-49
    3.6.3 HPS tbpA 基因序列分析  49-50
  3.7 HPS、Pm、APP、SS 的药物敏感试验  50-53
4 讨论与分析  53-58
  4.1 复合PCR 快速检测HPS、Pm、APP 感染的临床意义  53
  4.2 安徽省部分地区猪“高热病”中细菌感染情况及其优势血清型/基因型  53-54
  4.3 HPS 致病力的影响因素  54-56
  4.4 HPS、Pm、APP、SS 分离株药物感受性  56-58
结论  58-59
参考文献  59-66
致谢  66-67
附录  67-73
个人简介  73
研究生期间发表的论文  73

猪高热病细菌性病原的分离鉴定及其生物学特性研究

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