副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是猪的一种呼吸道共栖菌,在特定条件下可侵入机体而引起严重的全身性疾病,该病被称为副猪嗜血杆菌病或革拉泽氏病（Gl（a|¨）sser’s disease）。以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎和肺炎为主要特征,是目前危害全球养" />
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副猪嗜血杆菌保护性抗原的筛选与鉴定

作　者: 郭志伟
导　师: 周锐
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 副猪嗜血杆菌 重组蛋白 保护性抗原 小鼠 猪
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


猪嗜血杆菌 的学位论文">副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是猪的一种呼吸道共栖菌,在特定条件下可侵入机体而引起严重的全身性疾病,该病被称为副猪嗜血杆菌病或革拉泽氏病（Gl（a|¨）sser’s disease）。以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎和肺炎为主要特征,是目前危害全球养猪业最严重的细菌性传染病之一。HPS至少有15种血清型,不同地区和猪场流行的优势血清型不尽相同,血清型间的毒力和抗原性差异较大,缺乏有效的交叉免疫保护力。因此,研制特异、敏感和快速的分型与诊断方法,鉴定有效的交叉保护性抗原对副猪嗜血杆菌病的有效防控具有重要意义。本研究运用动物试验,从本实验室鉴定出的HPS体内诱导基因和应激响应基因中筛选保护性抗原,为诊断试剂和基因工程疫苗的研制奠定基础。对本实验室运用转录序列选择性捕获（SCOTS）技术筛选到的38个HPS体内诱导表达基因、39个热应激基因和36个贫铁应激基因,进行了生物信息学分析,根据其细胞定位、疏水性、抗原性预测结果,筛选和克隆了其中33个基因,在大肠杆菌中诱导表达,纯化了其中24种重组蛋白。用重组蛋白免疫小鼠制备了DnaK、GidA、GmhA、ComJ、RffA、SiaB、AlaS和Mivm八种多克隆抗体。用免疫荧光染色和流式细胞术研究了这8种蛋白在HPS中的细胞定位及与猪肺上皮细胞（St.Judeporcine lung cell,SJPLC）的相互作用,结果表明,DnaK、PilA、RffA和SiaB为HPS的表面蛋白,GidA、PilA、RffA和SiaB能够与SJPLC细胞结合。将重组蛋白DnaK、GidA、PilA、RffA和SiaB分别与氢氧化铝佐剂混合制备成亚单位疫苗,与佐剂对照和HPS灭活疫苗对照分别免疫30日龄仔猪各3头,间隔2周加强免疫2次,二周后用2×1010 CFU的HPS血清5型0165强毒株攻击。根据仔猪存活率、抗体水平、临床症状和病理剖检情况进行综合评价,结果显示:Ⅳ型菌毛蛋白PilA具有较好的免疫保护力。由于该抗原基因在HPS的15种血清型菌株中高度保守,有望能提供交叉保护作用,可以作为新型疫苗的候选抗原。

全文目录


摘要  7-8
Abstract  8-9
缩略语表(Abbreviation)  9-10
1 文献综述  10-24
  1.1 猪嗜血杆菌 的学位论文">副猪嗜血杆菌病的病原学  10-15
    1.1.1 副猪嗜血杆菌的概述  10
    1.1.2 副猪嗜血杆菌的病原特性  10-11
    1.1.3 副猪嗜血杆菌的血清型  11-12
    1.1.4 副猪嗜血杆菌的毒力因子  12-15
  1.2 副猪嗜血杆菌病的流行病学  15-16
  1.3 副猪嗜血杆菌病的临床症状与病理变化  16-18
    1.3.1 临床症状  16-17
    1.3.2 病理变化  17-18
  1.4 副猪嗜血杆菌病诊断  18-20
    1.4.1 免疫学诊断  18-19
    1.4.2 分子生物学诊断  19-20
  1.5 副猪嗜血杆菌病的防控现状  20-24
    1.5.1 加强饲养管理  20-21
    1.5.2 药物控制  21
    1.5.3 免疫预防  21-24
2 研究目的与意义  24-25
3 材料与方法  25-43
  3.1 材料  25-31
    3.1.1 菌株与培养基  25
    3.1.2 质粒  25-27
    3.1.3 PCR引物  27-29
    3.1.4 常用分子生物学试剂  29-31
    3.1.5 其它试剂盒材料  31
    3.1.6 试验动物:  31
  3.2 生物信息学分析  31
  3.3 细菌的培养  31
  3.4 副猪嗜血杆菌基因组DNA的提取  31-32
  3.5 PCR扩增  32
  3.6 质粒的提取  32-33
  3.7 DNA酶切  33
  3.8 琼脂糖凝胶电泳  33-34
  3.9 DNA的回收  34
  3.10 DNA的连接  34-35
  3.11 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化  35
  3.12 重组蛋白的诱导表达  35-36
  3.13 重组蛋白的提取与纯化  36-37
    3.13.1 上清中重组蛋白的提取与纯化  36
    3.13.2 包涵体中重组蛋白的提取与纯化  36-37
  3.14 蛋白质浓度的测定  37
  3.15 SDS-PAGE电泳  37-38
  3.16 多克隆抗体的制备  38-39
  3.17 副猪嗜血杆菌膜蛋白的提取  39
  3.18 Western blot  39-40
  3.19 流式细胞术分析蛋白在细菌表面的分布  40
  3.20 重组蛋白与猪肺上皮细胞的相互作用  40-41
  3.21 仔猪免疫与攻毒试验  41
    3.21.1 仔猪免疫试验  41
    3.21.2 仔猪攻毒实验  41
  3.22 仔猪临床症状和病理变化的综合评分标准  41-42
  3.23 ELISA方法检测重组蛋白抗体滴度  42-43
4 结果与分析  43-52
  4.1 候选基因在副猪嗜血杆菌不同血清型菌株中的分布  43
  4.2 候选基因的克隆、表达与纯化  43-45
  4.3 多克隆抗体的的效价测定  45
  4.4 候选蛋白质的细胞定位  45-50
    4.4.1 候选蛋白生物信息学预测  45-46
    4.4.2 候选蛋白Western blot验证  46-47
    4.4.3 流式细胞仪术进行蛋白定位分析  47-48
    4.4.4 免疫保护性抗原对细胞的粘附作用  48-50
  4.5 重组蛋白的免疫原性  50-52
    4.5.1 重组蛋白的免疫保护效率  50-51
    4.5.2 抗体滴度  51
    4.5.3 蛋白对仔猪免疫效力实验  51-52
5 讨论  52-55
6 结论  55-56
参考文献  56-60
致谢  60

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