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虎源H5N1亚型流感病毒HA与NP基因核酸疫苗的实验研究

作　者: 耿长国
导　师: 彭广能；夏咸柱
学　校: 四川农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 虎 H5N1亚型流感病毒 血凝素 核蛋白 核酸疫苗 攻毒保护性实验
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目的:构建能够分别表达虎源H5N1亚型流感病毒HA和NP蛋白的真核表达质粒,用所构建的真核表达质粒免疫小鼠,检测各质粒的体液免疫和细胞免疫水平,以及攻毒保护率,通过本实验为哺乳动物尤其是老虎H5N1亚型流感病毒核酸疫苗的研究奠定理论与技术基础。方法:应用常规分子生物学方法,构建表达虎源H5N1亚型流感病毒HA和NP基因的真核表达质粒pVAX-HA和pVAX-NP;构建同时表达H5N1亚型流感病毒HA基因和猫IL-18基因的双表达质粒pIRES2-IL-18-HA;构建同时表达H5N1亚型流感病毒NP基因和猫IL-18基因的双表达质粒pIRES2-IL-18-NP;应用间接免疫荧光和间接ELASA的方法检测各真核表达质粒在哺乳动物细胞BHK-21中的表达情况;采用肌肉注射的方法,用所构建的四种真核表达质粒免疫小鼠,共免疫3次,每次间隔15天,共设pVAX-HA、pVAX-NP、pVAX-HA和pVAX-NP联合、pIRES2-IL-18-HA、pIRES2-IL-18-NP、pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP联合、PBS对照7个免疫组。三次免疫后15天,用间接ELASA的方法检测各组小鼠产生的抗AIV的抗体水平;用MTT法检测各组小鼠产生的细胞免疫水平;用H5N1亚型流感病毒强毒株滴鼻攻毒,检测各组的攻毒保护率。结果:成功的构建了表达虎源H5N1亚型流感病毒HA和NP蛋白的四种真核表达质粒,即pVAX-HA、pVAX-NP、pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP;这四种真核表达质粒均能在哺乳动物细胞BHK-21中表达具有生物活性的HA和NP蛋白,均能诱导小鼠产生特异性的细胞和体液免疫;各免疫组小鼠在受到超大剂量(10000MLD50/只)的强毒攻击后,各组免疫保护率分别为:pVAX-HA组60%、pVAX-NP组20%、pVAX-HA和pVAX-NP联合组60%、pIRES2-IL-18-HA组20%、pIRES2-IL-18-NP组0%、pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP联合组20%、PBS对照组0%。结论:本实验以H5N1亚型流感病毒HA和NP基因为目的基因,所构建的四种真核表达质粒均能表达出具有生物活性的外源蛋白,并能诱导小鼠产生免疫保护作用,在受到超大剂量(10000 MLD50/只)的强毒攻击后,其中真核表达质粒pVAX-HA的免疫效果最好,可以为小鼠提供60%的保护率。这为哺乳动物H5N1亚型流感病毒核酸疫苗的研究提供了理论与技术基础。

全文目录


中文摘要  4-5
ABSTRACT  5-13
前言  13-15
第一部分 文献综述  15-45
  第一章 禽流感病毒病原学及流行病学研究  15-35
    1 流感病毒(IV)概述  15-17
      1.1 流感病毒的分类  15
      1.2 流感病毒的形态与结构  15-17
    2 禽流感病毒(AIV)病原学特点  17-28
      2.1 AIV的分类与命名  17-18
      2.2 AIV的理化特性  18
      2.3 AIV的基因组及其编码蛋白质  18-28
        2.3.1 编码血凝素(Hemagglutinin,HA)基因及其蛋白质  18-20
        2.3.2 NA基因及其编码的神经氨酸酶  20-21
        2.3.3 编码核衣壳蛋白(Nucleoprotein,NP)基因及核蛋白  21-22
        2.3.4 M基因及编码的基质蛋白  22-24
        2.3.5 其他基因片段及编码蛋白  24-25
        2.3.6 AIV的复制分子机制与基因遗传变异性  25-28
    3 H5N1亚型禽流感流行现状  28-32
      3.1 H5N1禽流感在禽类中流行现状  28-30
      3.2 H5N1禽流感病毒在候鸟中的流行  30
      3.3 H5N1禽流感病毒对哺乳动物的感染  30-31
      3.4 H5N1禽流感病毒对人的感染  31-32
    4 H5N1亚型流感病毒的进化  32-33
    5 结语  33-35
  第二章 核酸疫苗的研究进展  35-45
    1 核酸疫苗概述  35-36
    2 核酸疫苗的发展简史  36-37
    3 核酸疫苗的免疫机理  37-38
    4 增强核酸疫苗免疫效果的方法  38-42
      4.1 目的基因的选择  38-39
      4.2 构建高效表达的重组质粒  39
      4.3 接种组织的预处理  39-40
      4.4 免疫途径、免疫剂量和免疫次数  40
      4.5 免疫增强剂和佐剂  40-42
    5 核酸疫苗在畜禽领域的研究进展  42-44
    6 核酸疫苗存在的问题与展望  44-45
第二部分 研究内容  45-74
  实验一 虎源H5N1亚型流感病毒HA与NP基因的克隆、测序及其核酸疫苗的构建  45-66
    1 材料与方法  45-54
      1.1 材料  45-46
        1.1.1 病毒株、细胞株、工程细菌和质粒  45
        1.1.2 主要试剂  45-46
        1.1.3 主要仪器  46
      1.2 实验方法  46-54
        1.2.1 感受态菌的制备(CaCl2转化法)  46
        1.2.2 质粒DNA的小量制备(碱裂解法)  46
        1.2.3 质粒DNA的大量制备(碱裂解法)  46-47
        1.2.4 连接物的转化  47
        1.2.5 DNA琼脂糖凝胶电泳  47-48
        1.2.6 总RNA的提取  48
        1.2.7 HA和NP基因的扩增、克隆及测序  48-49
        1.2.8 核酸疫苗真核表达载体pVAX-HA和pVAX-NP的构建  49-50
        1.2.9 核酸疫苗真核表达载体pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP的构建  50-52
        1.2.10 所构建的四种真核表达质粒在真核细胞中的表达及检测  52-54
    2 结果  54-63
      2.1 A/Tiger/Harbin/132/2007 HA和NP基因的PCR扩增、克隆和测序分析  54-57
      2.2 pVAX-HA和pVAX-NP真核表达载体的构建及鉴定  57
      2.3 pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP真核表达载体的构建及鉴定  57-60
        2.3.1 猫IL-18基因的PCR扩增、克隆和测序分析  57-58
        2.3.2 pIRES2-IL-18载体的构建及鉴定  58-59
        2.3.3 pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP真核表达载体的构建及鉴定  59-60
      2.4 所构建的四种真核表达质粒在BHK-21细胞中的表达和检测  60-63
        2.4.1 间接免疫荧光检测结果  60-61
        2.4.2 间接ELISA检测结果  61-62
        2.4.3 猫IL-18基因在真核细胞中的表达检测结果  62-63
    3 讨论  63-65
      3.1 目的基因的选择  63-64
      3.2 毒株的选折  64
      3.3 核酸疫苗表达载体的选择  64-65
    4 小结  65-66
  实验二 核酸疫苗的小鼠免疫与攻毒保护性试验  66-74
    1 材料与方法  66-68
      1.1 材料  66
        1.1.1 毒株与质粒  66
        1.1.2 实验动物及主要试剂  66
      1.2 方法  66-68
        1.2.1 pVAX-HA、pVAX-NP、pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP的制备  66
        1.2.2 小鼠分组与免疫  66-67
        1.2.3 攻毒  67
        1.2.4 免疫小鼠血清抗AIV抗体的检测  67
        1.2.5 免疫小鼠抗AIV细胞免疫水平的检测(淋巴细胞转化实验MTT法)  67-68
    2 结果  68-71
      2.1 抗AIV抗体水平检测结果  68
        2.1.1 抗AIV ELISA抗体水平检测结果  68
        2.1.2 抗AIV HI抗体检测结果  68
      2.2 免疫小鼠的脾淋巴细胞转化试验检测结果  68-69
      2.3 攻毒保护性试验结果  69-71
        2.3.1 攻毒后的临床表现  69-70
        2.3.2 核酸疫苗保护率结果  70-71
    3 讨论  71-73
      3.1 AIV核酸疫苗的免疫效果分析  71-73
        3.1.1 不同载体核酸疫苗免疫效果的差异  71
        3.1.2 不同目的基因核酸疫苗免疫效果的差异  71
        3.1.3 联合免疫与单独免疫效果的差异  71-72
        3.1.4 关于HI试验结果  72
        3.1.5 核酸疫苗免疫效果的总体评价  72-73
      3.2 免疫实验总结与后续工作展望  73
    4 小结  73-74
结论  74-75
参考文献  75-83
致谢  83

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 血清学
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