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鸭瘟病毒UL26.5基因的原核表达及在病毒感染细胞定位研究

作　者: 张瑶
导　师: 程安春；汪铭书
学　校: 四川农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 鸭瘟病毒 UL26.5基因 分子特性分析 克隆表达 转录分析 细胞定位
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 43次
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内容摘要


根据本实验室鉴定的鸭瘟病毒(DPV)UL26.5基因(GenBank登录号EF643564)设计并合成了特异性引物,对DPV UL26.5基因进行PCR扩增、序列测定及生物信息学分析,并开展了UL26.5基因原核表达和抗体制备、在病毒感染鸭胚成纤维细胞中UL26.5基因的转录分析及表达产物的细胞定位检测,获得如下结果:1.DPV UL26.5基因的分子特性DPV UL26.5大小为1074bp,编码357aa。UL26.5蛋白含有6个保守功能结构域和1个丝氨酸蛋白酶水解位点,且具有与其功能相关的磷酸化位点;编码的多肽链中亲水区域大于疏水区域,是一种膜外蛋白。系统进化树表明DPV UL26.5基因与GaHV-2、GaHV-3、MeHV-1等禽类疱疹病毒的进化关系最近,与其它疱疹病毒关系较远。2.DPV UL26.5基因原核表达及其多克隆抗体制备对扩增的UL26.5基因进行pMD18-T载体克隆,通过对pMD18-T-UL26.5及pET-32a(+)进行BamHI、XhoI双酶切、连接,将UL26.5基因定向插入pET-32a(+),经BamHI和XhoI双酶切鉴定表明,成功构建重组表达质粒pET-32a-UL26.5,并转化入表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,表达产物以可溶性蛋白形式存在,大小为59KD左右。对表达条件进行优化,确定最佳表达条件为IPTG 0.2mmol/L,37℃诱导4h。利用重组表达蛋白所带的6×His标签用镍柱亲和层析方法对其进行纯化,获得较高纯度的重组蛋白。过柱纯化蛋白对家兔进行免疫,制备兔高免血清,Western-blotting检测显示,其能识别该重组表达蛋白;琼脂扩散实验效价达1:32。3.DPV体外感染宿主细胞UL26.5基因的转录分析通过荧光定量PCR方法对鸭瘟病毒UL26.5基因在鸭胚成纤维细胞的转录分析表明,随着接毒时间的延长,DPV UL26.5基因的转录产物呈先缓慢增长,后急剧上升,再缓慢下降的趋势。12h之前UL26.5基因处于低转录水平,随后转录产物量迅速放大,到54h达到高峰后有所下降,并一直持续到感染后72h。这种转录表达谱与UL26.5基因的特性和功能,以及病毒的增殖有关。4.DPV UL26.5基因产物在鸭胚成纤维细胞中的表达与定位通过细胞免疫荧光进行病毒感染鸭胚成纤维细胞的定位检测,结果表明特异性荧光可在感染后10h的胞核中检测到,随着感染时间的延长,越来越多的细胞核中出现特异性荧光,且荧光由点状逐渐向核膜聚集。这种分布特征变化可初步推测为DPV基因组编码的UL26.5蛋白在细胞核中组建成支架,进一步促进核衣壳的装配,并从衣壳内部释放等功能相关。

全文目录


中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-6
缩略词表  6-13
第一部分 文献综述及选题目的和意义  13-21
  第一章 疱疹病毒UL26.5基因及其编码蛋白研究进展  13-21
    1. 鸭瘟病毒概述  13-14
      1.1 鸭瘟病毒形态  13
      1.2 鸭瘟病毒形态发生  13-14
      1.3 鸭瘟病毒基因的研究现状  14
    2. 疱疹病毒 UL26.5基因及其编码蛋白的研究进展  14-20
      2.1 疱疹病毒分类  14
      2.2 疱疹病毒衣壳的结构和组成  14-15
      2.3 疱疹病毒UL26.5基因序列及其编码蛋白的特点  15
        2.3.1 UL26.5基因序列的特点  15
        2.3.2 UL26.5氨基酸序列的特点  15
      2.4 UL26.5蛋白的作用  15-18
        2.4.1 UL26.5蛋白对病毒生长影响  15-16
        2.4.2 UL26.5蛋白自身的联结  16
        2.4.3 UL26.5蛋白的细胞定位  16-17
        2.4.4 UL26.5蛋白的核定位  17
        2.4.5 UL26.5蛋白参与衣壳装配  17-18
        2.4.6 UL26.5蛋白的磷酸化  18
      2.5 UL26.5蛋白与其它蛋白的相互作用  18-20
        2.5.1 UL26.5蛋白与 UL19蛋白的连接  18-19
        2.5.2 UL26.5蛋白与 UL6蛋白的连接  19-20
      2.6 展望  20
    3. 选题目的和意义  20-21
第二部分 试验研究  21-67
  第二章 序列分析  21-31
    1. DPV UL26.5基因与其它疱疹病毒 UL26.5基因参考序列  21
    2. 生物信息学分析工具  21
    3. 方法  21-23
      3.1 UL26.5基因的获得  21
      3.2 斑点杂交试验对 UL26.5基因的验证  21-23
        3.2.1 UL26.5基因探针的制备  21-22
        3.2.2 杂交检测程序  22-23
        3.2.3 核酸探针特异性检测  23
      3.3 UL26.5基因的序列分析  23
    4. 结果  23-29
      4.1 DNA斑点杂交检测 DPV UL26.5基因  23
      4.2 UL26.5基因的生物信息学分析  23-29
        4.2.1 UL26.5基因的序列  23-25
        4.2.2 疏水性分析  25
        4.2.3 信号肽分析  25-26
        4.2.4 跨膜区预测结果  26
        4.2.5 二级结构预测分析  26-27
        4.2.6 功能位点分析  27
        4.2.7 UL26.5氨基酸序列同源性分析  27-28
        4.2.8 UL26.5基因进化树的构建  28-29
    5. 讨论  29-31
  第三章 鸭瘟病毒 UL26.5基因克隆、表达及多克隆抗体的制备  31-51
    1. 材料  31-34
      1.1 菌株/载体  31
      1.2 实验动物  31
      1.3 主要工具酶及试剂  31
      1.4 主要溶液的配制  31-33
        1.4.1 制备鸭胚成纤维细胞相关溶液  31-32
        1.4.2 琼脂糖凝胶电泳所用溶液  32
        1.4.3 质粒提取相关溶液  32
        1.4.4 SDS-PAGE电泳相关溶液  32-33
        1.4.5 培养细菌所用溶液  33
        1.4.6 His标签重组蛋白纯化试剂  33
        1.4.7 弗氏佐剂  33
        1.4.8 免疫印迹相关试剂  33
      1.5 主要仪器设备  33-34
      1.6 其它  34
    2. 试验方法  34-42
      2.1 DPV基因组 DNA提取  34
        2.1.1 制备鸭胚成纤维细胞(DEF)  34
        2.1.2 DPV接种鸭胚成纤维单层细胞  34
        2.1.3 DPV DNA提取  34
      2.2 PCR扩增鸭瘟病毒 UL26.5基因  34-35
        2.2.1 引物设计  35
        2.2.2 UL26.5基因的PCR扩增  35
      2.3 UL26.5基因的 T-载体克隆与鉴定  35-37
        2.3.1 UL26.5基因的T-载体克隆  35
        2.3.2 重组质粒的鉴定  35-37
      2.4 UL26.5基因重组表达菌株的构建  37-38
        2.4.1 pMD18-UL26.5及表达质粒pET-32a(+)的提取、酶切与回收  37-38
        2.4.2 酶切回收产物pET-32a(+)与 UL26.5片段的连接  38
        2.4.3 重组表达质粒转化感受态细胞 DH5α  38
        2.4.4 转化菌落的鉴定  38
        2.4.5 重组表达菌株的构建  38
      2.5 重组蛋白的诱导表达及表达条件的优化  38-40
        2.5.1 重组表达菌株的培养及表达  38-39
        2.5.2 重组表达质粒 SDS-PAGE电泳检测  39
        2.5.3 重组质粒表达条件的优化  39-40
      2.6 重组蛋白的纯化  40
        2.6.1 样品制备(可溶性蛋白)  40
        2.6.2 镍 NTA琼脂糖凝胶 FF过柱纯化重组蛋白  40
      2.7 兔高免血清的制备  40-42
        2.7.1 免疫原的制备  40-41
        2.7.2 兔抗 DPV UL26.5高免血清的制备  41
        2.7.3 Western-blotting检测  41
        2.7.4 琼脂扩散试验检测兔抗 UL26.5抗体效价  41-42
      2.8 兔抗 DPV UL26.5高免血清 IgG的纯化及鉴定  42
        2.8.1 正辛酸—硫酸铵粗提取兔抗 DPV UL26.5 IgG  42
        2.8.2 兔抗 DPV UL26.5 IgG的纯化  42
        2.8.3 纯化IgG的纯度测定  42
    3. 结果  42-49
      3.1 鸭瘟病毒 UL26.5基因的扩增、克隆与鉴定  42-43
      3.2 重组表达质粒pET-32a-UL26.5的构建及鉴定  43-44
        3.2.1 表达质粒的重组与转化  43
        3.2.2 重组表达质粒pET-32a-UL26.5的酶切鉴定  43
        3.2.3 重组表达菌株的构建  43-44
      3.3 重组质粒的诱导表达及表达条件优化  44-46
        3.3.1 重组质粒的小量诱导表达  44
        3.3.2 IPTG浓度的优化  44-45
        3.3.3 诱导时间的优化  45-46
        3.3.4 诱导温度的优化  46
      3.4 重组蛋白的纯化  46-47
        3.4.1 镍 NTA琼脂糖凝胶 FF过柱纯化  46-47
        3.4.2 过柱纯化样品 SDS-PAGE电泳  47
      3.5 Western-blotting检测  47-48
      3.6 兔抗 UL26.5血清琼脂扩散试验效价的检测  48
      3.7 兔抗 DPV UL26.5 IgG的纯化及SDS-PAGE鉴定  48-49
    4. 讨论  49-51
  第四章 荧光定量 PCR检测鸭瘟病毒体外感染宿主细胞 UL26.5 mRNA的表达  51-60
    1. 材料  51-52
      1.1 毒株/细胞  51
      1.2 主要试剂及配制  51-52
        1.2.1 主要试剂  51
        1.2.2 细胞培养溶液  51-52
      1.3 主要仪器设备  52
      1.4 其它  52
    2. 实验方法  52-55
      2.1 鸭胚成纤维细胞的培养与病毒感染  52-53
      2.2 RNA提取  53
      2.3 总 RNA进行逆转录  53
      2.4 引物设计和合成  53
      2.5 引物特异性检测  53-54
        2.5.1 β-actin的特异性检测  53-54
        2.5.2 UL26.5基因的特异性检测  54
      2.6 制备标准品  54
      2.7 实时荧光定量 PCR标准曲线的制作  54
      2.8 实时荧光定量 PCR反应  54
      2.9 实时荧光定量 PCR结果分析  54-55
    3. 结果  55-58
      3.1 引物特异性检测  55
      3.2 标准曲线的制作  55-56
      3.3 DEF感染 DPV后 UL26.5基因的转录变化  56-58
    4. 讨论  58-60
  第五章 鸭瘟病毒体外感染鸭胚成纤维细胞中UL26.5基因的表达与定位  60-67
    1. 材料  60
      1.1 毒株/细胞  60
      1.2 主要试剂及配制  60
      1.3 主要仪器设备  60
    2. 实验方法  60-61
      2.1 间接免疫荧光检测 DPV UL26.5在鸭胚成纤维细胞定位的方法  60-61
        2.1.1 间接免疫荧光检测 DPV UL26.5基因产物细胞定位的方法  60-61
        2.1.2 特异性检测  61
        2.1.3 结果判定标准  61
      2.2 DPV UL26.5基因产物在细胞中定位的动态监测  61
    3. 结果  61-65
      3.1 间接免疫荧光检测 DPV UL26.5细胞定位条件的确定  61-62
      3.2 特异性试验  62
      3.3 DPV UL26.5基因产物在细胞定位的动态监测  62-65
    4. 讨论  65-67
第三部分 结论  67-68
第四部分 参考文献  68-75
致谢  75-76
作者简介  76

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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