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冬虫夏草无性型的鉴定和生长特性研究

作　者: 尹小武
导　师: 李荣秀；董德贤
学　校: 上海交通大学
专　业: 生物化工
关键词: 冬虫夏草 生长特性 虫草多糖 ITS碱基序列 分子鉴定 固体培养 正交试验
分类号: S567.35
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 333次
引　用: 1次
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内容摘要


冬虫夏草是我国一种传统的名贵中药,具有极其重要的药用价值。近年来由于天然冬虫夏草被过度采集,已经濒临灭绝危险。供不应求的矛盾促使人们寻找天然虫草的替代物,冬虫夏草无性型的分离和培养是有效途径之一。为此,本实验首先对冬虫夏草分离株进行了分子鉴定,全面研究其培养特征,测定其有效成分,这些研究为冬虫夏草无性型未来的商业化开发奠定了基础,为人工培养虫草菌丝体代替天然冬虫夏草提供依据。采用PCR及DNA测序的方法,对所保藏的冬虫夏草分离株rDNA ITS全序列进行分析,该分离株和数据库中AB067721（Hirsutella sinensis,日本）完全相同,与AJ309359（Hirsutella sinensis,贵州大学）相比在544位多一个G,在83位C与AJ488274（Hirsutella sinensis,台湾）的A相区别,以上结果表明分离株为冬虫夏草的真正无性型-中国被毛孢。同时和蛹虫草rDNA ITS序列进行比较,相似性仅有76%,显然属于不同的种。对中国被毛孢的固体培养基进行优化,发现在改良PDA上生长速度最快;研究其对温度的适应性,18℃为最适温度,25℃以上不能生长,并首次以图片说明菌株的这个特征;首次运用环境扫描电镜观察菌丝的显微结构,清晰显示了分生孢子的大小、形状和着生方式。详细报道的中国被毛孢菌落特征为以后的无性型分离和鉴定提供可靠依据。本实验探讨了大量元素、微量元素和氨基酸对中国被毛孢生长的影响,确定MgSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、赖氨酸、蛋氨酸能够促进生长,其中Fe3+为主要影响因素;另外,对该菌株的液体培养基进行优化,发现40天后改良PDB和PPDB中菌丝量最高,达到7.84-8.34g/L。且培养液颜色（棕褐色或黑色）越深,生长越旺盛。这部分所积累的固、液培养数据是中国被毛孢进一步培养工艺研究的基础。用反相高效液相色谱法测定中国被毛孢固体培养菌丝体腺苷和虫草素含量,用苯酚-硫酸法测定虫草多糖含量。结果表明,采用的乙腈-水梯度洗脱方法能将中国被毛孢中的腺苷和虫草素完全分开,腺苷和虫草素含量分别为342.7±5.20μg/g、10.41±1.32μg/g;虫草多糖含量为16.81±0.669%。同时比较菌丝体、藏联（蛹）虫草全体和子实体、藏联（蛹）虫草胶囊三种活性成分,结果中国被毛孢固体培养菌丝体腺苷和虫草素含量低于人工培养蛹虫草,而虫草多糖含量高于蛹虫草。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
符号说明  13-14
第一章 文献综述  14-38
  1.1 冬虫夏草的研究历史  14-15
  1.2 冬虫夏草的生物学特性  15-19
    1.2.1 冬虫夏草的形态特征  15-17
    1.2.2 冬虫夏草的生活史  17-18
    1.2.3 冬虫夏草的生态分布  18-19
  1.3 虫草属真菌的种类资源  19-20
  1.4 冬虫夏草无性型研究  20-27
    1.4.1 冬虫夏草无性型研究概况  21-25
    1.4.2 冬虫夏草无性型鉴定方法  25-27
  1.5 冬虫夏草培养  27-29
    1.5.1 冬虫夏草人工培育  27-28
    1.5.2 无性型的培养  28-29
  1.6 冬虫夏草的化学成分  29-36
    1.6.1 虫草多糖  29-31
    1.6.2 核苷  31-33
    1.6.3 虫草酸  33-34
    1.6.4 氨基酸  34
    1.6.5 无机元素  34
    1.6.6 其它  34-36
  1.7 冬虫夏草主要活性成分测定方法  36
    1.7.1 多糖测定方法  36
    1.7.2 核苷类测定方法  36
  1.8 研究目的和意义  36-38
第二章 冬虫夏草无性型分子鉴定  38-48
  2.1 引言  38
  2.2 材料和方法  38-41
    2.2.1 实验材料  38
    2.2.2 主要试剂  38-39
    2.2.3 仪器  39
    2.2.4 培养基和溶液  39-40
    2.2.5 实验方法  40-41
  2.3 结果和讨论  41-47
    2.3.1 DNA 提取及ITS 区PCR 扩增  41-42
    2.3.2 序列测定结果  42-43
    2.3.3 冬虫夏草分离株分子鉴定结果  43-45
    2.3.4 中国被毛孢和蛹虫草ITS 序列比较分析  45-47
  2.4 本章小结  47-48
第三章 冬虫夏草无性型培养  48-66
  3.1 引言  48
  3.2 材料和方法  48-54
    3.2.1 实验材料  48
    3.2.2 主要试剂  48-49
    3.2.3 实验仪器  49
    3.2.4 培养基和溶液  49-51
    3.2.5 实验方法  51-54
  3.3 结果和讨论  54-64
    3.3.1 中国被毛孢固体培养菌落特征  54-55
    3.3.2 中国被毛孢固体培养基优化  55-56
    3.3.3 中国被毛孢对温度的适应性  56-58
    3.3.4 菌丝显微观察  58-60
    3.3.5 矿质元素和氨基酸对中国被毛孢生长的影响  60-63
    3.3.6 低温处理对中国被毛孢生长的影响  63-64
    3.3.7 中国被毛孢液体培养生长特性  64
  3.4 本章小结  64-66
第四章 冬虫夏草无性型主要活性成分测定  66-74
  4.1 引言  66
  4.2 材料和方法  66-69
    4.2.1 实验材料  66
    4.2.2 试剂  66-67
    4.2.3 仪器  67
    4.2.4 实验方法  67-69
  4.3 结果和讨论  69-73
    4.3.1 中国被毛孢菌丝体主要活性成分测定  69-70
    4.3.2 中国被毛孢和蛹虫草活性成分比较  70-73
  4.4 本章小结  73-74
第五章 全文总结  74-76
参考文献  76-84
发表论文和申请专利情况  84-85
致谢  85

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 药用作物 > 菌类 > 冬虫夏草
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