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大蒜油拮抗2，5-己二酮脂质过氧化和抑制正己烷代谢活化研究

作　者: 高绪聪
导　师: 谢克勤
学　校: 山东大学
专　业: 卫生毒理学
关键词: 正己烷 2,5-己二酮 大蒜油 神经毒性 氧化损伤 代谢
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


正己烷（n-hexane）作为一种有机溶剂,工业应用广泛。环境中的正己烷经呼吸道、消化道、皮肤进入机体后,主要分布在脂肪含量较高的器官,如脑、肾、肝、脾、睾丸、血液等。在急性毒性分级中,正己烷属无毒类,但因其挥发性大、脂溶性高,并有蓄积作用,被考虑为高危害性毒物;且正己烷急慢性中毒具有不同的表现:人类正己烷急性中毒主要表现为急性脑病（中枢性抑制）和皮肤、粘膜刺激症;慢性中毒以神经毒性为主,主要表现为由于远端粗大神经纤维轴突退变而引起的感觉-运动型周围神经病。目前对正己烷中毒引起的神经毒作用尚没有特异的治疗方法。已知正己烷对染毒动物肝脏和神经组织具有明显的脂质过氧化损伤（lipidperoxidation damage,LPD）作用,引起过氧化产物含量升高及氧化-抗氧化酶活性改变,由此推测过氧化损伤可能是正己烷的中毒机制之一。大蒜油（garlic oil,GO）是从大蒜中提取的一类与水不相混溶的油状物,其主要成分为具有强还原性的各种硫化物,过氧化物及氧等均可被其还原,进而显著提高机体过氧化物酶的活性和降低过氧化产物的含量。2,5-己二酮（2,5-hexanedione,2,5-HD）作为正己烷的活性代谢产物,是正己烷神经毒性的主要介质。大蒜油是否能够拮抗2,5-HD导致的大鼠神经组织过氧化损伤,并减轻其引起的周围神经毒性国内外尚未见报道。本实验对Wistar雄性大鼠连续6周腹腔注射2,5-HD 300mg/kg.bw染毒,制造正己烷慢性中毒致神经毒性模型,并对染毒大鼠每天提前4-6小时分别灌胃给予40mg/kg.bw和80mg/kg.bw大蒜油进行预防性干预,给药期间测定不同时点各组大鼠神经行为学改变:后肢撑力指数、平衡指数和步态评分;并测定实验终点大鼠大脑、脊髓和坐骨神经的氧化-抗氧化状态:丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量、谷胱甘肽（glutathione,GSH）含量、总抗氧化能力（total antioxidant capability,T-AOC）和抑制羟自由基能力,以观察大蒜油对2,5-HD导致的脂质过氧化损伤和神经毒性的作用。正己烷的神经毒性主要由其代谢产物2,5-HD所致,细胞色素P450（cytochromeP450,CYP450）是正己烷的基本氧化代谢酶,在其代谢活化过程中起着重要作用;已有大量报道大蒜油对细胞色素P450具有明显抑制作用,并在多种动物疾病模型中得到验证,但大蒜油对正己烷代谢的影响至今尚未见相关报道。有研究显示血清中的2,5-HD水平与其靶器官坐骨神经中的含量呈明显正相关,并与正己烷的神经毒性关系密切,因此降低血清中的2,5-HD水平,将可能减少正己烷中毒的发生,并可反映正己烷代谢水平的改变。为了满足本实验对血清2,5-HD的测定要求,我们采用乙酸乙酯做萃取剂,并以无水碳酸钾（K2CO3）进一步提高其萃取效率,建立经HP-5毛细管气相色谱柱分离,氢火焰离子化检测器（FID）检测血清中2,5-HD的气相色谱方法,并对该方法的可行性进行了检验。在此基础上,设计一次灌胃给予昆明种小鼠正己烷3000mg/kg.bw,干预组小鼠于染毒前2小时给予80mg/kg.bw大蒜油,测定染毒后不同时点血清中2,5-HD含量、经不同剂量大蒜油（10mg/kg.bw、20mg/kg.bw、40mg/kg.bw、80mg/kg.bw）干预及染毒前后2小时分别给予80mg/kg.bw大蒜油,染毒后6小时血清中2,5-HD含量较单纯染毒小鼠的改变;并对不同性别和周龄小鼠经同剂量正己烷染毒后血清2,5-HD含量进行测定,探讨大蒜油对正己烷代谢的影响,及性别和年龄因素对正己烷毒性的作用,从而为预防正己烷中毒提供可行性实验依据。结果1.体重变化正常组大鼠体重稳定增长;模型组和大蒜油组体重增长均减缓,甚至出现负增长,模型组大鼠染毒3周后体重显著低于正常对照大鼠（P＜0.01）;大蒜油低剂量组2周后,大蒜油高剂量组1周后体重即明显低于模型大鼠（P＜0.01或P＜0.05）。2.大鼠神经行为学改变（1）步态及评分:大蒜油低、高剂量组大鼠染毒第4周即出现运动异常表现,较模型组大鼠提前一周;各组步态评分,模型组、大蒜油低、高剂量组较对照组均显著升高（P＜0.01）,且大蒜油高剂量组得分较模型组显著增高（P＜0.05）。（2）后肢撑力指数:与2,5-HD染毒0周比较,至第4周模型组、大蒜油低、高剂量组后肢撑力指数分别增长44%、50%、49%,均明显高于正常对照组大鼠（P＜0.01）,但三组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。（3）平衡指数:除对照组外,各组大鼠平衡指数均呈不同程度的降低,至染毒第4周模型组、大蒜油低、高剂量组分别降低30%、45%、68%,均显著低于正常对照组（P＜0.05或0.01）,且大蒜油高剂量组与模型组相比有统计学差异（P＜0.05）。3.大鼠各神经组织氧化-抗氧化指标的改变（1）MDA含量变化:模型组大鼠的大脑、脊髓和坐骨神经中MDA含量分别较正常对照大鼠增加26%、25%和17%（P＜0.05或0.01）,而大蒜油组较模型组减少32%～43%（P＜0.01）和32%～52%（P＜0.01）。（2）T-AOC的改变:模型组大鼠各神经组织T-AOC较对照组有所增强,但各组间均没有统计差异（P＞0.05）。（3）GSH含量改变:在各神经组织中,模型组大鼠GSH含量低于正常对照组,除大蒜油低剂量组大鼠坐骨神经中含量低于模型组外,其他各神经组织大蒜油组均高于模型组,但以上改变均无统计学意义（P＞0.05）。（4）抑制羟自由基能力:与正常对照组相比,模型组大鼠抑制羟自由基能力在大脑、脊髓和坐骨神经分别削弱34%、16%和28%（P＜0.05或0.01）;大蒜油不同程度的拮抗了这一趋势,大蒜油低剂量组大鼠分别较模型组增强22%、28%和28%（P＜0.01）,大蒜油高剂量组则为50%、46%和40%（P＜0.01）。4.小鼠血清中2,5-HD含量的改变（1）一次染毒代谢情况:一次性灌胃给予正己烷4000mg/kg.bw后,小鼠血清中2,5-HD含量随时间推移而增加,至10小时达峰值后逐渐降低,20小时后几乎不能检出。（2）不同剂量正己烷染毒后血清2,5-HD含量的改变:小鼠血清中2,5-HD含量随着正己烷染毒剂量的增加而增加,空白小鼠血清未检出;2000、4000和6000mg/kg.bw组小鼠,染毒8小时后血清中2,5-HD含量分别为8.04、16.68和22.38μg/ml,呈明显的剂量—效应关系。（3）大蒜油对正己烷染毒小鼠代谢的影响:经3000mg/kg.bw正己烷一次灌胃染毒后,染毒组与大蒜油干预组小鼠血清2,5-HD含量变化趋势与4（1）结果一致,均随时间延长先升高后降低;但大蒜油干预组小鼠各时间点血清含量均低于单纯染毒小鼠,其中染毒后4、6、8、10小时较染毒组2,5-HD含量显著降低（P＜0.05或0.01）。（4）不同剂量大蒜油对小鼠血清中2,5-HD含量的影响:染毒前2小时给予不同剂量大蒜油,染毒后6小时小鼠血清2,5-HD含量分别较染毒组减少16.2%、20.8%、22.8%（P＜0.05）和32.1%（P＜0.01）,显示明显剂量-效应关系。（5）不同时间给予大蒜油对小鼠血清中2,5-HD含量的影响:正己烷染毒前后2?时分别给予小鼠80mg/kg大蒜油,其血清中2,5-HD含量与单纯染毒组相比均明显降低（P＜0.05）;且染毒前给药组较染毒后给药组要低,但两组间差异没有统计学意义（P＞0.05）。（6）不同周龄小鼠血清中2,5-HD含量:不同周龄小鼠经同剂量正己烷一次性染毒8小时后,血清2,5-HD呈现不同水平（P＜0.05）:5周龄组（22.83μg/ml）高于4周龄（19.59μg/ml）和6周龄小鼠（16.42μg/ml）。（7）不同性别小鼠血清2,5-HD含量:不同性别小鼠经单次正己烷染毒后,雌鼠血清2,5-HD含量（13.22μg/ml）明显高于雄鼠（10.34μg/ml）,增高27.9%（P＜0.05）。5.小鼠血清2,5-HD的气相色谱测定（1）样品处理方法的选择及方法专一性:三种萃取剂回收率比较:二氯甲烷＞乙酸乙酯＞乙醚,结合挥发性及毒性等考虑,选择乙酸乙酯作为本方法的萃取剂;同时比较加入无水Na2SO4、无水K2CO3和不加盐时乙酸乙酯的萃取效率,发现加入适量盐可明显提高乙酸乙酯对2,5-HD的萃取效率,其中无水K2CO3效果更佳;该方法萃取剂乙酸乙酯（Rt=2.26min）和2,5-HD（Rt=3.33min）分离完全,且正己烷（Rt=2.266min）对目标物2,5-HD的测定不存在干扰。（2）方法学检测:方法最低检出浓度为0.03μg/ml,线性范围0.03μg/ml～80μg/ml;回收率83.8～99.9%;相对标准偏差（RSD）日内3.3%～5.2%,日间3.3%～8.0%;4℃下样品可保存24小时,-20℃可保存1周。结论1.大蒜油可拮抗2,5-HD所致的大鼠神经组织脂质过氧化损伤,但不能改善大鼠感觉运动神经功能异常,由此推测过氧化损伤可能不是2,5-HD中毒性神经病变的主要作用机制。2.大蒜油可抑制正己烷染毒小鼠2,5-HD的产生,使血清2,5-HD水平明显降低,且该抑制作用与大蒜油给药剂量和时间有关;同时年龄和性别因素对正己烷代谢也具有一定的影响,以上为我们预防和减少正己烷中毒提供了有效的实验依据。3.本实验建立的2,5-HD气相色谱测定方法,准确可靠,具有良好的重现性,可用于小鼠血清中2,5-HD含量的测定。

全文目录


中文摘要  6-10
英文摘要  10-16
符号说明  16-17
序言  17-33
  一、正己烷  17-25
  二、大蒜和大蒜油  25-27
  参考文献  27-33
第一部分 大蒜油拮抗2,5-己二酮对大鼠神经组织的氧化损伤效果研究  33-55
  前言  33-34
  材料与方法  34-36
  结果  36-44
  讨论  44-46
  附录  46-51
  参考文献  51-55
第二部分 小鼠血清2,5-己二酮的测定和大蒜油对正己烷代谢的影响  55-71
  前言  55-56
  材料与方法  56-58
  结果  58-66
  讨论  66-68
  参考文献  68-71
结论  71-72
攻读学位期间发表的学术论文  72-73
致谢  73-74
学位论文评阅及答辩情况表  74

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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